膵β細胞におけるインスリン遺伝子の転写調節機構の解析

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05670855
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 津田 謹輔 京都大学, 総合人間学部, 助教授 (10180001)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清野 裕 京都大学, 医学部, 助教授 (40030986)
• Keywords: インスリン遺伝子 / 転写 / CRE(cyclic AMP rospone element)

Research Abstract

平成5年度研究計画・方法に記載したごとく、単離胎児ラット膵β細胞に対する遺伝子導入の基礎的な検討より実験を開始した。使用する実験動物はウィスター系ラットであり、確定妊娠の母ラットより出産予定日の前日に胎児を取り出し、実験に供した。
胎児ラットより膵蔵を摘出し、夾雑組織を取り除いた後に細片化し、コラゲナーゼ処理・trypsin-EDTA処理を行なって細胞を分散した。引続きPRMI1640培地で培養の後、Electroporationによる遺伝子導入実験を行った。Electroporationの条件として、175〜500V/4mmの電場と25〜2500μFのcapacitanceを用いた。数回にわたり、遺伝子導入を試みた結果、試行の度に、至適条件は変化したが、175V-2500μFと450V-25μFの条件下では比較的安定した成績が得られた。並行して、Lipofectionによる遺伝子導入も試みたが、培地から血清を除くため、細胞を傷害する可能性があり、さらに、手技が煩雑なこと、試薬が高価なことなどから、以後の実験はElectroporation法で行うこととした。試薬の価格の問題が解消すれば、改めてLipofection法も検討すべきと考えられた。
前記の条件を用いたElectroporation法による遺伝子導入の系を利用し、ヒト・インスリン遺伝子の転写調節領域のDNA断片をChloramphenicol Acetyltransferase(CAT)発現プラスミドに組み込んだものを胎児ラット膵β細胞に導入した。この実験ではCAT活性はdibutyryl cyclic AMP負荷により4.6倍に亢進し、さらにブドウ糖負荷により13.4倍の活性の亢進を認めた。インスリン遺伝子の転写調節領域内のcyclic AMP Respone Element(CRE)に点変異を導入したプラスミドではdbcAMPあるいはブドウ糖によるCAT活性の亢進は2倍以内に抑制され、インスリン遺伝子の高濃度ブドウ糖による誘導にはCREが強く関与し、この際、cAMPを介さない系が存在することが示された。