1993 Fiscal Year Annual Research Report
LDLレセプター遺伝子及びアポA-I遺伝子発現細胞における抗動脈硬化機構の解明
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05670871
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
小堀 祥三 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (00201492)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮田 高雄 熊本大学, 医学部, 助手 (70244118)
岸川 秀樹 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (30161441)
七里 元亮 熊本大学, 医学部, 教授 (00028515)
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| Keywords | ヒトLDL receptor遺伝子 / transfection / electronporation法 / PVS2-neo / CHO細胞 / Hep G2細胞 |
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| Research Abstract |
ヒトLDL receptor遺伝子(pLDLR-2)のtransfection
【.encircled1.】trabsfection
electronporation法を用いてtransfectionを施行した。使用機器はGENE-PULSER(Bio-Rad社)を使用、ヒトLDL receptor geneのcDNAを持ったpiasmid(pLDLR-2)を0.16mug/mlに調整、選択用plasmidとしてPVS2-neoを用いた。選択用ネオマイシンとしてG418を用いた。
wild-type CHO(1×10^7/Flask)をtripsin 5mlにて剥し、50ml用チューブに移し、3,000rpm、2min遠心,沈殿分画に0.4mlのF12 mediumを加える。pipetting後、electroporation用キュベットへ移す。pLDL-R2を32mul(DNA量として5mug)加え、PSV2-neo1.5mugを加え、voltage0.2kV,time constant 18msecでelectronporationを施行した。
【.encircled2.】導入細胞のselection
キュベット中のtransfectionされたCHO細胞を10cm dishに撒き、F12 mediumを添加し、2-3日隔きにmediumを交換、第5日10cm dish3枚に分注、第7日G418を5mg/dish添加、第12日さらにG418を5mg/dish添加した。第22日confluentに達したCHO細胞の1/10量を2枚のdishに撒き、第29日1/20量を20枚のdishに分注、第36日corony 18個を採取、これを24well plateに移し、第46日各wellに生育したcoronyをそれぞれ6cm dishに移した。第55日各dishに生育した細胞を1/3に希釈し3枚の10cm dishに分注、それぞれに命名し、一部はstock、他は培養を継続した。
【.encircled3.】CHO細胞へのpLDL-R2導入の確認
1)binding assay
wild type CHOとCHO′-pLDL-R2のヒトLDLに対するbinding assayを施行し、それぞれkd=11.2と43.5mug/ml,Bmax=0.09と0.30mug/mg cell proteinであり、CHO-pLDL-R2が親和性および結合能いずれも明らかに高値を示した。
2)Western blotting
CHO-pLDL-R2の膜蛋白をSDS-PAGE(3-12%)を施行後、これをニトロセルロース膜に転写し、一次抗体として抗ヒトモノクローナルLDL抗体、二次抗体としてprotein Aを用いて160kDの位置に単一のバンドを認めた。
【.encircled4.】今後は、Hep G2の細胞あるいは家兎肝細胞に対してCHOと同様の実験を施行する予定である。
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