ヒト顆粒膜細胞における特異蛋白の発現調節に関する研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05671362
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 福垣 洋行 名古屋大学, 医学部, 助手 (10252248)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近藤 育代 名古屋大学, 医学部, 助手 (40215447) ; 菅沼 信彦 名古屋大学, 医学部, 助教授 (30179113)
• Keywords: インヒビン / アクチビン / フォリスタチン / メッセンジャーRNA / 顆粒膜細胞 / PCR / RT-PCR

Research Abstract

1.本年度はまず、予備実験としてラット顆粒膜細胞を用い実験を開始した。未熟ラットに妊馬血清ゴナドトロピン(PMSG)を投与し、投与後、経時的(8,16,24,32,40時間)に顆粒膜細胞を卵巣より採取した。これらの顆粒膜細胞より総RNAをグアニジン-塩酸法により抽出した。
2.抽出されたRNAを逆転写酵素(RT)を用い二本鎖DNAに転換した。既に報告されているラット・インヒビンαサブユニット、またアクチビンとも共通のβAおよびβBサブユニットの塩基配列に対するプライマーを用い、DNA増幅装置によるRT-PCRを行い、各サブユニットの一部を増幅した。同時にβ-アクチンmRNAも同様に増幅し、対照とした。アガロース電気泳動法により増幅されたDNAを分離し、デンシトメーターを用い各々のバンドの濃度を測定した。β-アクチン量を基準にインヒビンα、βA、βBサブユニットの発現量を定量化した。
3.その結果、PMSG投与により顆粒膜細胞における各サブユニットの発現は、経時的に増加していることが明かとなった。すなわち、PMSGがラットではin vivoにおいてインヒビン、アクチビン遺伝子の発現を刺激していることが示唆された。
4.上記のRT-PCR法による定量化の信頼性を検討するため、PMSG投与後経時的に収集した大量の顆粒膜細胞よりRNAを抽出し、アガロース電気泳動を行った。これをニトロセルロース膜にノーザン・ブロット法により転写し、アイソトープにて標識したインヒビンα、βA、βBサブユニットおよびβ-アクチンcDNAを用いてハイブリダイゼーションした。その結果、上記のRT-PCR法と同様に、PMSGによる各サブユニットmRNA量の増加が観察された。以上の結果より、RT-PCR法による定量化はノーザン・トランスファーによる定量化と同等の定量性が得られることが明かとなった。