1994 Fiscal Year Annual Research Report
Na^+輸送NADHキノン・リダクターゼ遺伝子のクローニングと構造解析
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05671809
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
畝本 力 千葉大学, 薬学部, 教授 (30089601)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 万喜 千葉大学, 薬学部, 助教授 (50092086)
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| Keywords | ナトリウムイオン輸送 / ナトリウムポンプ / NADH-キノン・リダクターゼ / 呼吸鎖 / 電子伝達系 / 遺伝子解析 / 海洋細菌 / Vibrio alginolyticus |
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| Research Abstract |
海洋細菌Vibrio alginolyticusの細胞質膜から精製したNADH-キノン・リダクターゼ酵素複合体はα,β,γの異なる3種類のサブユニットで構成されている。本年度は昨年作成したプローブを用いて本酵素複合体のクローニングを進めた。V.alginolyticusから得たクロモソームDNAを部分的にSau3AIで消化後、10-20kbpの断片を分画し、これをλDASH IIアームに繋ぎ、パッケージした。NQR遺伝子を含むラムダ・ファージはジゴキシゲニンでラベルしたPCR産物(A,B,Cプローブ)を用いてプラークハイブリ法でスクリーニングした。陽性のラムダ・ファージは制限酵素で消化後、NQR遺伝子を含む部分をpUC118または119に繋いだ。プローブCで選択したクローンの中に、βサブユニットを発現するクローンを見いだすことができた。βサブユニットの発現が大腸菌TG1にクローニングしたプラスミッドを導入し、増殖して得た菌体から膜分画を調製し、界面活性剤存在下にゲル電気泳動を行ない、これをNADHとメナジオンおよびMTT色素による活性染色によって確認した。さらに、βサブユニットに特異的な抗体により染色し、ゲル上の位置が合致することを確かめた。この方法により、NQR B遺伝子はNQR C遺伝子の下流に存在することが確認された。また、4個のオープンリーディングフレームを持つ遺伝子のシーケンスを終了し、NQR遺伝子の解析に成功した。
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[Publications] Uncmoto,T.: "Na^+ Translocating NADH Quinone Reductase of Marine and Halophilic Bacteria." Journal of Bioenergetics and Biomembranes.Vol.25. 385-391 (1993)
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[Publications] Unemoto,T.: "Modifications by Na^+ and K^+ and the Site of Ag^+ Inhibition in the Na^+ Translocating NADH Quinone Reductase fron a Marine Vibrio alginolyticus." Biochimoca et Biophysica Acta.Vol.1183. 201-205 (1993)
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[Publications] Hayashi,M.: "Cloning of Na^+ Translocating NADH Quinone Reductase Gene from the Marine Vibrio alginolyticus and the Expression of β-Subunit in Escherichia coli." FEBS Letters.Vol.356. 330-332 (1994)
