Adeno-Associated Virusベクターの試験管内構成系の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05671888
• Research Institution: NIPPON MEDICAL SCHOOL
• Principal Investigator: 平井 幸彦 日本医科大学, 医学部, 講師 (10089617)
• Keywords: 遺伝子治療 / 組換えウイルス / アデノ随伴ウイルス / AAVベクター / パッケージング細胞

Research Abstract

AAVベクターのパッケイジング効率は,その機能を持つAAV Rep蛋白質の細胞内濃度に依存すると思われるが,この蛋白質は細胞増殖を抑制する事が知られている。そこで,グロココルチコイドによって活性化される誘導型プロモーター(MMTV LTR)の下流にRep遺伝子を繋ぎこんだ発現ベクターを構築し,これをゲノムへ組み込んだ細胞株へデキサメサゾン(DM)処理することによって,AAV Rep蛋白質の細胞内濃度を上昇させる方法を検討中である。作成した誘導型Rep蛋白質発現ベクターをHeLa細胞へ導入後,10μMDM処理を行うと,Rep蛋白質のmRNAが生成していることをRep遺伝子のプライマーを用いるRT-PCRにて確認した。現在,このベクターをHeLaおよび3T3細胞へ組み込んだ細胞株の性質を検討中である。また,この発現ベクターを基にして,バキュロウイルスによる昆虫細胞でのRep蛋白質発現系も検討中である。
大腸菌用融合蛋白質発現系(pMAL-cベクター)にて、マルトース結合蛋白質との融合蛋白質として分離した23kDaの外殻蛋白質は外殻を構成する3種の蛋白質全てに含まれる為、これを抗原として作成したmonoclonal抗体はAAVベクターに対する中和活性を持たなかった。現在,これらのmonoclonal抗体の性質を更に検討中である。また、反応系より選択的にAAVベクターを分離・濃縮する方法として確立した硫酸セルロース法は、10^<10>ウイルス粒子/ml(10^8 colony forming Units/ml)までAAVベクターを生物学的力価を保持したまま分離・濃縮出来る事を確認した。この知見はいAAVベクターの分離・濃縮に重要である。

Research Products

• [Publications] Kenji Tamayose: "A new strategy for large scale preparation of high titer recombinant adeno-associated virus(AAV) vectors by using packaging cell lines and sulfonated cellulose column chromatography." Human Gene Ther.7(in Press). (1996)
• [Publications] 平井幸彦: "遺伝子治療のためのウイルスベクターについて." 日医誌,. 62. 520-523 (1995)
• [Publications] 玉寄兼治: "II-1遺伝子導入法、アデノ随伴ウイルス." 酵素・核酸・蛋白、. 40. 2532-2538 (1995)
• [Publications] 玉寄兼治: "[原発性免疫不全症]血液細胞への遺伝子導入法の開発" 臨床科学,. 32. 209-215 (1996)