脳における細胞膜骨格蛋白質とアネキシンとの相互作用に関する研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05680676
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 乾 誠 大阪大学, 医学部, 助手 (70223237)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 謙一郎 大阪大学, 医学部, 助手 (90238105) ; 田中 潤也 大阪大学, 医学部, 助手 (70217040) ; 祖父江 憲治 大阪大学, 医学部, 教授 (20112047)
• Keywords: アネキシンVI / カルシウム / 燐脂質 / シナプシンI / 細胞膜骨格 / カルスペクチン

Research Abstract

神経細胞におけるアネキシンVIの機能を明かにすることを目的として、ラット脳におけるアネキシンVIの標的蛋白質の検索を行った。このためまずアネキシンVI結合解析法の確立を行った。これは、蛋白質をニトロセルロース膜に固定し、^<125>IでラベルしたアネキシンVIを用いてアネキシンVI結合蛋白質を検出あるいは解析するものである。本法を用いてラット脳のホモジネートを検索した結果、450K、350K、240K、180K、120-140K、105K、80K、63K、48K、40K、32K、27K、23K、16Kの約14種類の蛋白質と結合することが明らかとなった。アネキシンVIとこれらの蛋白質との結合は、Ca依存性で燐脂質の存在が必須であった。燐脂質では、フォスファチジルセリンあるいはフォスファチジン酸に特異的で、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノルアミンでは結合は認められなかった。また、アネキシンVIとこれらの結合蛋白質との結合は、直接の蛋白質同志の結合であった。これらの蛋白質のうち80Kは、P2分画さらにシナプス小胞分画に、240KはP2分画さらにTritonX-100で処理した細胞骨格分画に豊富に存在し、抽出条件および精製蛋白質との比較からそれぞれシナプシンIとカルスペクチンであることを同定した。さらにアネキシンVIとシナプシンIとの結合を詳細に検討した結果、アネキシンVIは、シナプシンIa,bの両者に結合し、NTCBフラグメントへの結合実験からシナプシンIのN末端頭部に結合することが判明した。アネキシンVIのシナプシンIへの結合を非変性条件下で調べた結果、フォスファチジルセリン存在下でのCa感受性は12.6μMで、Kdは270nMであった。アネキシンVIのシナプシンIへの結合は、シナプシンIのcAMPキナーゼ或いはCaMキナーゼIIによる燐酸化により著明に阻害された。シナプシンIは、シナプス前部におけるシナプス小胞のアクチンネットワークへの貯留に重要な役割を果たす。アネキシンVIのシナプシンIへの結合の生理機能は、現時点では不明であるが、そのCa感受性から考えてシナプス小胞のアクチンネットワークへの貯留に関与しているとは考え難く、むしろシナプス前膜直下で細胞膜とシナプス小胞の相互作用に関与している可能性が考えられる。

Research Products

• [Publications] Inui,M.: "Annexin VI binds to a synaptic vesicle protein,synapsin I." J.Neurochem.(in press). (1994)
• [Publications] Inui,M.: "Annexin VI-binding proteins in brain.in Neuronal Cytoskeleton" CRC Press, 355 (1993)