カルボニル還元酵素の光学活性アルコール類生産への応用と立体選択的反応機構の解析

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05760070
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 片岡 道彦 京都大学, 農学部, 助手 (90252494)
• Keywords: カルボニル還元酵素 / アルデヒド還元酵素 / 光学活性アルコール / レ-カルニチン / 立体選択的反応

Research Abstract

微生物酵素が触媒する立体選択的反応を利用して光学活性物質の生産を試みた。光学活性を生み出す酵素として微生物の生産するカルボニル還元酵素、特にアルデヒド還元酵素を取り上げた。まず、Sporobolomyces salmonicolor より本酵素をコードする遺伝子のクローニングを行い、さらに大腸菌における大量発現に成功した。本酵素は、4-ハロアセト酢酸エステル類(CAAE)を不斉還元して(R)-4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステル類(CHBE)を生成する酵素である。この反応を利用することによりL-カルニチン不斉合成が可能となる。そこで、大腸菌において大量発現した酵素を用いた、CAAEからのCHBE生産について検討した。その結果、組替え大腸菌を用いた菌体反応でも、S.salmonicolorの菌体を用いた菌体反応の時と同様に、約4%濃度のCHBEを生産することに成功した。さらに、S.salmonicolorを用いたときの生成CHBEの光学純度は10%ee程度であるのに対して、組替え大腸菌を用いるとほぼ100%eeのCHBEを生成させられることが判明した。しかし、組替え大腸菌においては反応に必要なNADPHの再生系が欠失しており、NADPH再生系としてグルコース脱水素酵素を添加する必要があった。今後、さらに高濃度の(R)-CHBEを生産するための条件検討を行つていく予定である。
また、組替え大腸菌より大量に得られたアルデヒド還元酵素を用いて結晶化の検討を行つたところ、X線結晶解析に適するような結晶が得られた。本結晶を用いて、高次構造解析を行い、活性中心における立体選択的反応機構の解析を行つていく。

Research Products

• [Publications] M.Kataoka: "Optical resolution of pantolactone and related lactones" Biotechnology Progress. 10(in press). (1994)
• [Publications] K.Kita: "Sequence analysis of aldehyde reductase from sporobolomyces" J.Bacteriol.(in press). (1994)