受精における卵および精子の細胞内活性化機構に関する研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05771247
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 増本 伸之 大阪大学, 医学部, 助手 (70243235)
• Keywords: 受精 / 卵表層顆粒 / エキソサイトーシス / NSF

Research Abstract

今回の研究の目的は、受精直後の初期反応である卵細胞内カルシウムの上昇とそれに続く卵表層顆粒のエキソサイトーシスをリアルタイムに測定する方法を確立し、さらに細胞内カルシウム変動とエキソサイトーシスの間に介在するセカンドメッセンジャーを同定することであった。 細胞内カルシウムとエキソサイトーシスはカルシウム感受性蛍光色素Fura2で卵細胞質を標識し、非透過性膜標識蛍光色素TMA-DPHで卵細胞膜を標識することによって測定された。 これらの測定は340、380nmの2波長励起に対する510nmの蛍光比と360nm励起に対する450nm蛍光量をそれぞれコンピューター処理装置付き蛍光顕微鏡で解析することにより行われた。
またエキソサイトーシスは、共焦点レーザー顕微鏡によりその時間的な変動が画像化された。 実験はマウス卵と精子を使って行われた。細胞内カルシウムの上昇は精子の卵細胞膜への融合直後より始まり、一過性の上昇のみの場合とカルシウム振動をみる場合があった。卵表層顆粒のエキソサイトーシスは精子融合後約10分で始まり60分まで続いた。 このエキソサイトーシスはBAPTA-AMで細胞内カルシウムをキレートし、その上昇をおさえた場合、完全に制御された。 ゆえにエキソサイトーシスが細胞内カルシウムの上昇に依存していることが示された。 次に、細胞内カルシウム変動とエキソサイトーシスの間に介在するセカンドメッセンジャーを同定するために、他の内分秘細胞でその介在が示唆されている因子、カルモジュリン、アクチン、低分子量Gプロテイン、NSF等について検討した。 この結果、卵表層顆粒のエキソサイトーシスにはカルモジュリン、アクチン、低分子量Gプロテインは関与せず、NSPのみにその関与が示唆された。 これらの結果の論文は現在投稿準備中である。