好熱性細菌で働く第二の呼吸鎖末端酸化酵素の単離およびその構造と機能の研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05780461
• Research Institution: Kyushu Institute of Technology
• Principal Investigator: 坂本 順司 九州工業大学, 情報工学部・生化システム, 助教授 (80175364)
• Keywords: 好熱性細菌 / 呼吸鎖 / シトクロム・オキシダーゼ / バシラス・ステアロサーモフィラス

Research Abstract

1.バチルス属好熱性細菌の呼吸鎖末端酸化酵素の研究にこれまでよく用いられたPS3株は、外来遺伝子の導入が極めてむづかしかつた。そこで、近縁のBacillus stearothermophilus K1041株にスイッチして研究を進めた。K1041株をニトロソグアニジンで処理して突然変異を誘発した。N,N,N´,N´-tetramethyl-p-phenylenediamine(TMPD)の酸化活性が低下している菌16株を分離した。
2.これらの膜分画を調整した。酸化還元スペクトルおよびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるヘム染色から見て、従来のcaa_3型オキシダーゼを欠くと考えられる突然変異体が1つあった。その菌の膜分画はしかしNADHを基質とした呼吸活性を示すことから、別の型のオキシダーゼが存在すると考えられた。以後、この菌のオキシダーゼの同定、単離をめざした。
3.この菌は野生株に比べ、低下しているとはいえTMPD酸化活性を示した。しかし、TMPDに対するKmは変化していた。またこの活性に対するシアンの阻害定数は低くなっていた。この菌のシトクロムの吸収スペクトルはシアンによって変化した。この変化は、高スピン型から低スピン型に転換したとして解釈できた。
4.この菌の膜分画から、TMPD酸化活性を指標として、界面活性剤を用いてオキシダーゼを抽出し、各種クロマトグラフィーによって精製を試みた。nonanoyl-N-methyl glucamideとdecanoyl-N-methyl glucamideの1対1混合物を用いた。陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイト、ゲル濾過の3段階で精製を進め、かなりの蛋白質が除去できた。現在この精製法をさらに改良し、サブユニット構成を明らかにすることを目指している。