非天然アミノ酸導入タンパク質を用いたタンパク質の膜透過機構の解析

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06044091
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 遠藤 斗志也 名古屋大学, 理学部, 教授 (70152014)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): SCHULTZ Pete カリフォルニア大学, 化学教室, 教授 ; 西川 周一 名古屋大学, 理学部, 助手 (10252222) ; 中井 正人 名古屋大学, 理学部, 助手 (90222158)
• Keywords: 非天然アミノ酸 / ミトコンドリア / 前駆体 / 膜透過

Research Abstract

タンパク質は、生体膜を通過して細胞内の特定の部位に移行することにより、はじめてその機能を果たすことができるが、膜透過のメカニズム、関与するタンパク質などについては、不明な部分が多い。本研究では、Schultzらの開発した方法により、ミトコンドリアタンパク質前駆体に架橋性の官能基を有する非天然アミノ酸を導入し、ミトコンドリア膜透過反応に関与するタンパク質を、光化学反応による架橋により同定することをめざした。ミトコンドリアタンパク質前駆体pCOXIV-DHFRの様々な位置に架橋用非天然アミノ酸を導入するために、各々の位置に対応するコドンをamberナンセンスコドン(TAG)に置換した変異遺伝子を作製した。大腸菌ライセ-トではなくウサギ網状赤血球ライセ-トを用いて合成したタンパク質の方が、in vitroのミトコンドリア膜透過反応の効率が良いので、ウサギ網状赤血球ライセ-トを用いて非天然アミノ酸を導入する条件を検討し、最適条件を確立した。架橋用アミノ酸を導入したpCOXIV-DHFRを作製し、in vitroでミトコンドリアに効率よく取り込まれることを確認した。次に系からATPを除去することにより、膜透過反応の中間体を作った。この状態で光を照射し、膜透過反応中間体の架橋反応を行った。このままだと非特異的な架橋も起こるので、現在、膜透過反応特異的な架橋反応が起こる条件を検討中である。また、ATPの除去ではなく、前駆体の高次構造を安定化することによって膜透過反応中間体を作るために、pSu9-DHFRに架橋用アミノ酸を導入すること、in vitroでのタンパク質合成効率を上げるために、SP6ポリメラーゼ用プロモータを用いる方法を検討中である。

Research Products

• [Publications] Nakai,M. et al.: "Ygelp,a eukaryotic GrpE homolog,is localized in the mitochondrial matrix and interacts with mitochondrial hsp70." Biochem. Biophys. Res. Commun.200. 435-442 (1994)
• [Publications] Nakai,M. et al.: "Identification and characterization of the SecA protein homologue in the cyanobacterium Synechococcus PCC7942" Biochem. Biophys. Res. Commun.200. 844-851 (1994)
• [Publications] Endo,T. et al.: "Chloroplast protein import: chloroplast envelopes and thylakoids have different ability to unfold proteins.21GC03:Eur. J. Biochem." 225. 403-409 (1994)
• [Publications] Nakai,M. et al.: "Identification of the SecA protein homolog in pea chloroplasts and its possible involvement in thylakoidal protein transport." J. Biol. Chem.269. 31338-31341 (1994)
• [Publications] Nakai,M. etal.: "Identification of yeast MAS17 encoding the functional counterpart of the mitochondrial receptor complex protein MOM22 of Neurospora classa." FEBS Lett.357. 202-206 (1995)
• [Publications] Endo,T. et al.: "Mitochondrial presequences can induce aggregation of unfolded proteins." FEBS Lett.359. 93-96 (1995)