1996 Fiscal Year Annual Research Report
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06045012
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| Research Institution | TOKYO Inst.Technology |
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Principal Investigator |
吉田 賢右 東京工業大学, 資源化学研究所, 教授 (90049073)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
MONTAL Mauri Dept. of Physics Univ. of California, 教授
宗行 英朗 東京工業大学, 資源化学研究所, 助手 (80219865)
ALLISON Will Dept. of Chemistry and Blochemistry Univ., 教授
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| Keywords | ATP / ATP合成 / ATP合成酵素 / F1-ATPアーゼ / ヌクレオチド結合 / サブユニット / ユニサイト活定 |
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| Research Abstract |
X線構造解析の結果から、F_1-ATPaseのムクレオチド結合部位数は、6個であることが確認されている。これらのうち、3個は直接ATPの加水分解反応に関与する触媒部位、残る3個はATP加水分解を行わない非触媒部位である。現在までのところ、3個の触媒部位は、ATP加水分解に際し協同的に働くことが知られている。しかし、これら複数の触媒部位間の相互作用の実態に関しては、依然不明のままである。我々は、これに関して新たな知見を得るために、触媒部位がそれぞれ3(野生型),2,1,0個のα_3β_3γ複合体を精製し、そのATP加水分解反応の性質を調べた。
変異βサブユニットのC末端にグルタミン酸10個(Glu・Tag)を接続したサブユニットを用いてα_3β_3γ複合体を作製し野生型複合体と混合した。尿素で変性させ、透析し複合体を再編成した。これによりサブユニットの組換えが起こり、活性のある触媒部位数が、3(3.型),2(2.型),1(1.型),0個(0型)となった4種類の複合体が得られる。4種の複合体は、Glu・Tagに由来する負電荷を利用して陰イオン交換HPLCで分離精製できる。その結果、(1)定常状態のATPase活性…3.型複合体以外の3種の複合体では検出されなかった。また、F_1-ATPaseを活性化する中性界面活性剤LDAO(Lauryl Dimethylamine Oxyde)の添加によっても3.型複合体以外では、顕著な活性化が見られなかった。(2)TNP-ATPのunisite水解活性…活性のある触媒部位が残っている3.型,2.型,1.型の各複合体には観察されたが、0型複合体では認められなかった。(3)Chase promotion活性…結合したTNP-ATPの加水分解が後から加えた過剰のATPによって促進される現象(Chase promotion)は、活性のある触媒部位が2個以上ある3.型及び2.型複合体で観察された。1.型及び0型複合体ではこの様な現象は観察されなかった。
定常状態のATPase活性が3.型複合体にのみ検出されたことから、定常状態でのATPase活性は、3つの基質結合部位が協同的に作用し合って働くことが必要であると結論づけられる。これは、共有結合を形成するF_1-ATPaseの阻害剤の多くが、複合体あたり1分子結合して失活させる、という結果と良く一致している。
Unisite条件下のATPase活性の測定では、2.型複合体にはChase promotionが見られるが、1.型及び0型複合体では検出されなかった。したがって、1個目の結合ATPの加水分解を促進するためには、2個目の触媒部位にATPが結合し、さらに加水分解されることが必要である。Chase promotionに使用するヌクレオチドをATPからADPに置き換えると、3.型複合体でもChase promotionが観察されなくなることから、2個目の触媒部位における加水分解がChase promotionの必要な条件であることが示唆される。
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[Publications] Naji,H.,Yasuda,R.,Yoshida,M.,Kinosita,K.: "Direct observation of the rotation of F_1-ATPase" Nature. (in press). (′97)
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[Publications] Matsui,T.,Dou,C.,Allison,W.S.,Yoshida,M.: "Catalytic activity of the α_3β_3γ complex of F_1-ATPase without noncatalytic nucleotide Binding Site" J.Biol.Chem. 272. (in-press) (′97)
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[Publications] Jault,J-M,Dou,C.,Allison.W.S.,Yoshida,M.: "The α_3β_3γ subcomplex of the F_1-ATPase with the βT165S substitution does not entrap inhibitory MgADP" J.Biol.Chem. 271. 28818-28824 (′96)
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[Publications] Amano,T.,Hisabori,T.,Muneyuki,E.,Yoshida,M.: "Catalytic activity of α_3β_3γ complexes of F_1-ATPase with 1,2,or3 catalytic sites" J.Biol.Chem. 271. 17343-17348 (′96)
