アポトーシスの機構と機能

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06045054
• Research Institution: Science University of Tokyo
• Principal Investigator: 田沼 靖一 東京理科大学, 薬学部, 教授 (10142449)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): ZANNETTA Jea ルイパストウール大学, 教授
• Keywords: アポトーシス / DNA断片化 / DNAエンドヌクレアーゼ / DNaseγ / 細胞死

Research Abstract

ラット及びウシ胸腺細胞核には、CM5PWHPLCで分離される3種のエンドヌクレアーゼが存在することを見出し、DNaseα、β、γと命名した。ウシ胸腺細胞にX線を照射した後、経時的に細胞を採集、核内のDNase活性の変動を調べたところ、DNaseαとβはアポトーシスに伴に速かに減少するのに対して、DNaseγはアポトーシスを起こした核に保持されていた。そこで、正常なラット胸腺細胞からDNaseαとβを、アポトーシスを誘発させたそれからDNaseγを、種々のカラムクロマトグラフィーを用いて精製をおこなった。完全精製したDNaseの標品を用いてその性質を詳細に検討した。DNaseαとβは共に、分子量32kDaの2価陽イオン非依存性の酸性エンドヌクレアーゼであった。一方DNaseγは分子量33kDaの中性エンドヌクレアーゼであった。
DNaseγの精製標品をリシルエンドペプチダーゼ、又はアルパルティックエンドペプチダーゼで処理し、得られたペプチドをHPLCにより文取し、気相アミノ酸シークエンサーによってそれらの部分アミノ酸配列を決定した。これらの部分アミノ酸配列を基にプローブを作製し、ラット胸腺cDNAライブラリー(λgtll)よりクローニングを行ない、その全塩基配列を決定した。このcDNAの解析から、DNaseγ遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)は933塩基より成り、予想されるアミノ酸配列(310アミノ酸残基)から、DNaseγはN末端にプリカーサーペプチド(25アミノ酸残基)を有することがわかった。又、興味深いことに、このプリカーサー領域にはロイジンジッパーが存在していた。一方、N末端及びC末端には、核移動シグナルを表す塩基性アミノ酸のクラスターが存在していた。DNase活性を担う活性中心は内部に存在し、しかもDNaseIに類似していることが判明した。
本研究において、アポトーシスの顕著な特徴であるDNAのヌクレオソーム単位での断片化を司るエンドヌクレアーゼを世界で初めて同定し、完全精製することができた。さらにDNaseγのcDNAクローニングにも世界で初めて成功し、その全塩基配列を決定しタンパク質の一次構造を明らかにすることができた。これらの成果は、DNaseγの遺伝子発現、及び活性化機構を解明する上で重要な手掛りとなる知見である。また、ここを足場として、アポトーシスの実行過程の分子メカニズムを解明する突破口となる成果である。

Research Products

• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "An endonuclease responsible for apoptosis." Apoptosis : Prog.Mol.Subcell.Biol.Springer-Verlag. 1-12 (1995)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Molecular mechanisms of apoptosis." Apoptosis in Normal Development and Cancer(ed.by Mels Sluyser),Taylor & Francis Ltd.,London UK,. 39-59 (1996)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Inhibitory effect of tannic acid on human immunodeficiency virus promoter activity induced by 12-0-teradecanoylphorbol-13-acetate in Jurkat T-cells." Biochem.Biophys.Res.Commun.220. 411-417 (1996)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "DNA fragmentation during thymic apoptosis is catalyzed by DNaseγ." Apoptosis. 1. 147-152 (1996)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Properties of poly(ADP-ribose)glycohydrolase purified from pig testis nuclei." Arch.Biochem.Biophys.336. 139-146 (1996)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Replication factor C recognizes5'-phosphate ends of telomeres." Biochem.Biophys.Res.Commun.229. 310-315 (1996)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Antioxidative activity of sodium benzylidencascorbate and its adoriamycin-induced cardiac toxicity." Anticancer Res.14. 1875-1880 (1994)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "A Macrocircular ellagitannin,oenothein B,supresses mouse mammary tumor gene expression via inhibition of poly(ADP-ribose)glycohydrolase." Biochem.Biophys.Res.Commun.210. 329-337 (1995)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Induction of autoantibodies in normal mice by injection of nucleobindin and natural occurrence of antibodies against nucleobindin in autoimmune MRL/Ipr/Ipr mice." Immunol.Lett.45. 35-42 (1995)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Apoptosos : a cell ellimination mechanism." Sut.Bull.12. 36-43 (1995)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Induction of apoptosis by T2 toxin and other natural toxins in HL-60 human promyelotic leukemia cells." Natural Toxins. 3. 129-137 (1995)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "DNA fragmentation in apoptosis." Tiss.Cult.Res.Commun.14. 133-140 (1995)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Occurence of an NAD+ glycohydrolase in bovine brain cytosol." Arch.Biochem.Biophys.308. 327-329 (1994)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Change in electrophoretic mobility of HL-60RG cells by apoptosis." Colloid and Polymer Sci.272. 487-492 (1994)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Induction of DNA Fragmentation in Human Myelogenous Leukemic Cell Lines by Sodium 5,6-Benzylidene-L-Ascorbate and its Related Compounds" Anticancer Res.14. 969-976 (1994)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Mutiple forms of nuclear deoxyribonuclease in rat thymocytes." Biochem.Biophys.Res.Commun.203. 3789-3797 (1994)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Sodium benzylideneascorbate induced apoptpsis in HIV-replicating U1 cells." FEBS Lett.351. 105-108 (1994)
• [Publications] Sei-ichi Tanuma: "Identification of an endonuclease responsible for apoptosis in rat thymocytes." Eur.J.Biochem.226. 23-30 (1994)
• [Publications] 田沼 靖一: "アポトーシス - 細胞の生と死 -" 東京大学出版会, 145 (1994)
• [Publications] 田沼 靖一: "アポトーシス実験プロトコール" 秀潤社, 236 (1994)
• [Publications] 田沼 靖一: "アポトーシス - 機能と機構 -" 日経サイエンス社, 185 (1995)
• [Publications] 田沼 靖一: "アポトーシスの制御機構" 羊土社, 242 (1995)
• [Publications] 田沼 靖一: "アポトーシスとは何か -死からはじまる生の科学-" 講談社, 239 (1996)
• [Publications] 田沼 靖一: "アポトーシスの分子機構 「生命のプログラムとアポトーシス」" 日本アクセル・シュプリンガー, 175 (1996)