ショック蛋白質(DnaK,DnaJ,GrpE)による複製開始蛋白質(RepE)の活性化機構

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06261223
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 和田 千恵子 京都大学, ウイルス研究所, 助手 (10175698)
• Keywords: 分子シャペロン / 複製開始蛋白質(RepE) / 二量体の解離 / 分子シャペロンとRepEの複合体

Research Abstract

大腸菌の性決定因子であるF及びミニFは染色体あたり約1コピーで保持されている。このコピー数調節において複製開始蛋白質(RepE)の役割は大きい。RepEの二つの機能(イニシエーター、リプレッサー)が各々単量体と二量体に対応しており、イニシエーター/リプレッサーの機能変換が単量体と二量体の構造変換として理解できる事を明きらかにした。この二量体から単量体への変換に分子シャペロン(DnaK,DnaJ,GrpE)が関与している可能性を今年度検討した。これが明かになれば、この系は分子シャペロンの作用機構を解析するための優れたモデル系となる。
本年度の研究計画と研究実績
(1)正常RepEの複製開始領域(DR)、オペレーター(IR)への結合に及ぼすDnaK,DnaJの効果をDR又はIRのDNAをプローブにして精製RepE,DnaK,DnaJを用いてゲルシフトAssayで調べた。正常RepEのDRへの結合能はDnaK,DnaJ,ATPの量に比例してDRへの結合能が増大する事が明らかとなった。
(2)細胞粗抽出液からRepEと分子シャペロンとの複合体をニッケルアフィニティカラム、架橋剤を用いて見つけることが出来た。UVクロスリンカーによる方法も試みる予定をしている。
(3)RepEの種々の変異体を用いて分子シャペロン(DnaK,DnaJ)との複合体の形成能を調べることにより、RepEの分子シャペロンとの相互作用領域を決定した。
(4)RepEの二量体/単量体の変換におけるDnaK,DnaJ,GrpEの役割を再構成系を作り調べる。この研究は試験管内でRepEの二量体、DnaK,DnaJ,GrpEを反応し、グリセロール濃度勾配遠心法によりRepEの単量体の形成を調べる試みをしたが、卓上超遠心機がないために、試料が多量にいるために充分な条件を決定することが出来なかった。

Research Products

• [Publications] Masamichi Ishiai et al.: "Replication initiator protein RepE of mini-F plasmid:Functional differentiation between monomers(initiator)and dimers(autogenous repressor)" Pros.Natl.Acad.Sci.91. 3839-3843 (1994)
• [Publications] Fujihiko Matsunaga et al.: "DNA-binding domain of the RepE initiator protein of mini-F plasmid:Involment of a carboxyl-terminal region" Journal of Bacteriology. 177. (1995)