1994 Fiscal Year Annual Research Report

ハロ酸分解性微生物酵素の遺伝子工学的研究と環境浄化への応用

Research Project

Project/Area Number	06271240
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	左右田健次京都大学, 化学研究所, 教授 (30027023)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	平澤敏子京都大学, 化学研究所, 教務職員 (80238352) 吉村徹京都大学, 化学研究所, 助手 (70182821) 江崎信芳京都大学, 化学研究所, 助教授 (50135597)
Keywords	加水分解的脱ハロゲン反応 / デハロゲナーゼ / L-2-ハロ酸デハロゲナーゼ / DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼ / 反応機構 / 一時構造
Research Abstract	Pseudomonas sp.YLのL-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、L-2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、対応するD-2-ヒドロキシ酸を与える。本酵素の触媒反応機構を解析した。1分子の酵素が1回だけ反応を触媒するSingle Turnoverの反応と、1分子の酵素が複数回反応を触媒するMultiple Turnoverの反応をH_2^<18>O中で行い、生成物2-ヒドロキシ酸への^<18>Oの取り込みの有無を調べた。L-2-クロロプロピオン酸を基質としたところ、生成物乳酸への^<18>Oの取り込みはMurltiple Turnoverの反応でのみ認められた。これは、溶媒の水分子の酸素原子が、いったん酵素分子に取り込まれた後、基質に取り込まれたことを示唆している。H_2^<18>O中で反応を行った酵素をプロテアーゼで分解し、得られたペピチド断片をタンデムMS/MS法で分析した結果、Asp10に^<18>Oが取り込まれていることが明らかとなった。以上の結果から、酵素のAsp10の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を攻撃してハライドイオンが脱離し、生成したエステル中間体が溶媒の水分子によって加水分解されて2-ヒドロキシ酸が遊離するという機構で、反応が進行するものと考えられた。 DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、2-ハロ酸の両異性体に作用し、立体反転で対応する2-ヒドロキシ酸を与える。Pseudomonas sp.113から本酵素の遺伝子を単離し、塩基配列を決定した。ORFは921bpからなり、307アミノ酸をコードしていた。推定分子量は34,242で精製酵素のサブユニット分子量と良い一致を示した。本酵素は、D-体のハロ酸に特異的に作用するD-2-ハロ酸デハロゲナーゼと21.5%の相同性を示した。

Research Products

(4 results)

All Other

All Publications (4 results)

[Publications] A.K.M.Q.Hasan: "Two kinds of 2-halo acid dehalogenases from Pseudomonas sp.YL induced by 2-chloroacrylate and 2-chloropropionate" Biosci.Biotech.Biochem.58. 1599-1602 (1994)
[Publications] J.Q.Liu: "Purification and characterization of thermostable and nonthermostable 2-haloacid dehalogenases with different stereospecificities from Pseudomonas sp.strain YL" Appl.Environ.Microbiol.60. 2389-2393 (1994)
[Publications] V.Nardi-Dei: "Comparative studies of genes encoding thermostable L-2-halo acid dehalogenase from Pseudomonas sp.strain YL,other dehalogenase,and two related hypothetical proteins from Escherichia coli." Appl.Environ.Microbiol.60. 3375-3380 (1994)
[Publications] J.Q.Liu: "Reconsideration of the essential role of a histidine residue of L-2-halo acid dehalogenase" J.Biochem.116. 248-249 (1994)

1994 Fiscal Year Annual Research Report

ハロ酸分解性微生物酵素の遺伝子工学的研究と環境浄化への応用

Principal Investigator

左右田 健次 京都大学, 化学研究所, 教授 (30027023)

Research Products

[Publications] A.K.M.Q.Hasan: "Two kinds of 2-halo acid dehalogenases from Pseudomonas sp.YL induced by 2-chloroacrylate and 2-chloropropionate" Biosci.Biotech.Biochem.58. 1599-1602 (1994)

[Publications] J.Q.Liu: "Purification and characterization of thermostable and nonthermostable 2-haloacid dehalogenases with different stereospecificities from Pseudomonas sp.strain YL" Appl.Environ.Microbiol.60. 2389-2393 (1994)

[Publications] V.Nardi-Dei: "Comparative studies of genes encoding thermostable L-2-halo acid dehalogenase from Pseudomonas sp.strain YL,other dehalogenase,and two related hypothetical proteins from Escherichia coli." Appl.Environ.Microbiol.60. 3375-3380 (1994)

[Publications] J.Q.Liu: "Reconsideration of the essential role of a histidine residue of L-2-halo acid dehalogenase" J.Biochem.116. 248-249 (1994)

左右田健次京都大学, 化学研究所, 教授 (30027023)