蛋白質の吸着構造のH-D交換による解析法の開発

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06276214
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 河野 敬一 北海道大学, 理学部, 助教授 (10136492)
• Keywords: ハイドロキシアパタイト / リゾチーム / オステオカルシン / 吸着 / 重水素交換 / NMR

Research Abstract

固体表面において重要な働きをしている蛋白質の存在が近年知られるようになってきた。骨組織中のオステオカルシン等は無機質(ハイドロキシアパタイト)に吸着して骨組織の吸収・成長を制御しており骨粗しょう症のマーカーとしても有名である。幼若歯牙エナメル質に存在するアメロゲニンにも同様の働きが知られている。他にも固体表面における蛋白質の振る舞いが問題になる場合は多く、クロマトグラフィー担体への蛋白質の吸着様式、人工血管に対する血液蛋白の吸着等が挙げられる。これら吸着した蛋白質の吸着部位の同定と吸着コンフォメーションの解析は重要な課題でありながらこれまで方法論の困難さから研究はほとんど進展していない。我々はH-D交換と2次元NMRを組み合わせた新しい方法を開発した。すなわち吸着剤を充填したカラムに蛋白質の軽水溶液を流して吸着させ、中性の重水バッファーで置換することによってH-D交換反応を開始させる。一定時間インキュベートした後、酸性の重水バッファーを流して蛋白質を溶離させるとともに反応を停止させる。2次元NMRを測定することにより交換の遅くなったアミドプロトン即ち吸着部位を決定することができる。ハイドロキシアパタイトに対するニワトリリゾチームの吸着部位をこの方法で検討したところLys-13を中心とした正電荷の集団がアパタイト表面のリン酸基の負電荷と結合することが推定された。この結果を検証するためLys-13の側鎖をLeu-129のC端カルボキシル基とアミド結合させたところ、吸着の強さには変化がなかったことからLys-13の正電荷とC端の負電荷は塩橋を作ることによって打ち消しあっており吸着には直接寄与していないことがわかった。またCM-Toyopearlに対するニワトリリゾチームの吸着はアパタイトに対するよりも10倍強く吸着部位は複数の部位にわたっており、CM基が自由度を持っていることにより効果が考えられた。ヒトリゾチームのアパタイトに対する吸着は生理的にも重要であること、またニワトリと比べてArg-128が欠如していることから同様の実験を行ったところ、ヒトとニワトリはほぼ同じ結果であり、正電荷の密度がアパタイトに対する吸着において重要であることが示唆された。今後はオステオカルシン等のより生理的に重要な情報認識蛋白質に研究を広げていく予定である。

Research Products

• [Publications] S.Iwanaga et al.: "Structure-function relationships of fachyqlesins and their analogues." Ciba Foundation Symposium. 186. 160-175 (1994)
• [Publications] T.Imoto et al.: "Lysozyme requires fluctuation of the active site for the manifestation of activity." Protein Engineering. 7. 743-748 (1994)