rho遺伝子産物の細胞内機能とがん細胞形質発現における役割

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06281231
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 成宮 周 京都大学, 医学部, 教授 (70144350)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森井 成人 京都大学, 医学部, 講師 (80220036)
• Keywords: ras類似蛋白質 / GTP結合蛋白質 / rho遺伝子産物 / チロシンリン酸化 / 蛋白質キナーゼ / 細胞接着 / 細胞運動

Research Abstract

rho遺伝子産物の細胞内機能と機能発現の分子機構を明らかにするため以下の実験を行った。
1.Swiss 3T3 fibroblastを用い、ボンベシン・エンドセリンで細胞を刺激したときにおこる蛋白質チロシンリン酸化におけるrho P12の機能を解析した。ボンベシン・エンドセリンは、3T3細胞で受容体・3量体G蛋白質を介し、focal adhesion kinase(P125FAK),paxillinなどの蛋白質のチロシリン酸化をおこし、細胞接着・ストレスファイバーの亢進をおこす。このときボツソヌスC_3酵素を用いて細胞内のrho P21を特異的にADDリボシル化し不活化すると、上記蛋白質のチロシンリン酸化は消失し細胞接着も減少した。これにより、rho P21が、生理活性ペプチドの刺激を2ndメッセンジャー以後の過程で受け、チロシンリン酸化に伝えるリンカーとして働いていることがわかった。
2.3T3細胞、ラット3Y1細胞を用い、renaturation kinase assayを用いて、rho P21の下流で活性化されるキナーゼの同定を試みた。これにより、分る量60K,64K,85K,145Kのセリン・スレオニンキナーゼがrho P21の下流で働いていることが明らかとなった。
[^<35>S]GTTPγSをプローブとしたリガンドオーバーレ-法で細胞オ-モジネートのrho P21結合蛋白質を検索し、分子量160K(P160)の蛋白質を同定、精製した。この蛋白は、rho P21にGTP依存性に結合した、また結合はrho P21に特異的で、rac,CDC42 P21には弱くしか結合しなかった。

Research Products

• [Publications] Jalink,K.et al.: "Inhibition of lysophosphatidate-and thrombin-induced neurite retraction and neuronal cell ronunding by ADPribosylation of the small GTP-binding protein rho." Journal of Cell Biology.126. 801-810 (1994)
• [Publications] Rankin,S. et al.: "Botulinum C3 exoenzyme blocks the tyrosine phospory-lation of p125^<FAK> and paxillin induced by bombesin and endotheiin." FEbs Letters.354. 315-319 (1994)
• [Publications] Morii,N.& Narumiya,S.: "Preparation of native and recombinant botulinum C3 ADP-ribosylation." Methods in Enzymology.(in press). (1995)
• [Publications] Tominaga,T.et al.: "Lymphocyte aggregation assay and inhibition by botulinum C3 ADP-ribosytransferase." Methods in Enzymology.(in press). (1995)
• [Publications] SeckI,M.J.et al.: "GTPγS stimulates tyrosine phosphorylation of p125^<FAK> and paxillin in permeabilized Swiss 3T3 cells:role p21." Journal of Biological Chemistry.(in press). (1995)