蛋白発現ベクターを応用した神経線椎腫症1型の遺伝子異常の解析

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06282237
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 松尾 雅文 神戸大学, 医学部, 教授 (10157266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西尾 久英 神戸大学, 医学部, 助手 (80189258)
• Keywords: 神経線椎腫症1型 / NF1 / 点突然変異 / がん抑制遺伝子

Research Abstract

神経線椎腫症1型(NF1)が、がん抑制遺伝子であるNF1遺伝子の異常により発生することが知られている。NF1は最も頻度の高い常染色体優性の遺伝疾患の1つで、そのなかに神経組織に悪性腫瘍を発生する例が見られる。そのため、NF1はがん抑制遺伝子の異常と発がんに関する格好のモデルとして多くの研究者から強い注目を集めている。ところが、NF1遺伝子は多くのエクソンからなる大きな遺伝子で、その異常を明らかにすることは極めて困難で、NF1患者の2割未満でしか遺伝子の異常は確定されない。本研究では、患者NF1メッセンジャーRNA(mRNA)からcDNAを合成し、これを発現ベクターに組み込み、発現させた蛋白での異常をまず同定し、その情報をもとに遺伝子の異常を決定しようとするものである。
今回、mRNAから蛋白を発現させるまでの実験系の確立を図った。その結果、白血球内に微量にした存在しないNF1mRNAを逆転写PCR法にて増幅DNA断片として得ることに成功した。
PCRにはT7プロモーター配列を付加し、転写がT7ポリメラーゼにより進行するようにした。そして、増幅DNAより転写されたmRNAを基質としてビオチンで標識したリジントランスファーRNA存在下に翻訳させ、ビオチン標識された蛋白を得た。さらに標識蛋白をサザーンブロット法でセルロース膜に移し、標識蛋白を化学発光法にて検出する、非常に複雑であるが微量にメッセンジャーRNAから合成される蛋白を検出する鋭微な方法を確立することに成功した。

Research Products

• [Publications] Hagiwara,Y.: "A novel point mutation(G-1 to T)in a 5′splice donor site of intron 13 of the dystrophin gene results in exon skipping and is responsible for Becker muscular dystrophy." Am.J.Hum.Genet.54. 53-61 (1994)
• [Publications] Nishio,H.: "Identification of a novel first exon in the human dystrophin gene and of a new promoter located more then 500 kb upstream of the nearest known promoter." J.Clin.Invest.94. 1037-1042 (1994)
• [Publications] Takeshima,Y.: "Modulation of in vitro splicing of the upstream intron by modifying an intra-exon sequence which is deleted from the dystrophin gene in dystrophin kobe." J.Clin.Invest.(in press).