N_2レーザービームによる遺伝子導入の効率化と植物保護分野への利用に関する研究

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06404009
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 尾崎 武司 大阪府立大学, 農学部, 助教授 (00081555)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古川 一 大阪府立大学, 農学部, 助手 (40240957) ; 森川 利信 大阪府立大学, 農学部, 講師 (90145821) ; 大木 理 大阪府立大学, 農学部, 講師 (00128761) ; 森源 治郎 大阪府立大学, 農学部, 講師 (20081515) ; 山口 俊彦 大阪府立大学, 農学部, 助教授 (30081558)
• Keywords: N_2レーザーマイクロビーム / 直接遺伝子導入 / 植物細胞 / キユウリモザイクウイルス / Cucumis figarei / ウイルス抵抗性

Research Abstract

前年に引き続きN_2レーザーマイクロビームによる植物細胞への遺伝子導入を試みた。導入遺伝子としてはPBI121またはPBI221を用い、X-Glucを基質とする組織化学的分析により一過的なGUS遺伝子の発現を調べた。レーザー出力は植物または組織の種類により異なったが、3〜12μj/spotの範囲が最適であった。導入率はホウセンカ、ユリ、タバコ等の花粉細胞で高く、最高導入率は各々24%,30.4%,18.7%であり、他の直接導入方法に比べて50〜100倍の効率であった。一方培養細胞(メロン、タバコ、ニンジン等)への導入率は植物の種類や培養日数により大きく異なった。さらにメロン葉組織ならびにプロトプラストへのCMV-RNAの導入実験では高率にウイルスの感染が認められた。Cucumis figareiのCMV に対する抵抗性は組織レベルでのみ発現し、移行阻害が主な機構であることを明らかにした。また、CMVは系統により高温下ではCucumis figareiに全身感染するもの(pepo)と局部感染にとどまるもの(Y)があることを見出し、この現象に関与するウイルス因子を探索するためにpepo-RNAのクローニングを行った。Reasortment実験よりpepoのRNA-3が全身移行に関与していることを明らかに、し、その塩基配列を決定した。さらに抵抗性に関与する宿主因子の探索や移行阻害機構解明のためにCPに対するモノクローナル抗体を作成した。メロンおよびC.figareiからの固体再生条件の検討では、メロン胚軸組織からの不定胚の形成条件、ならびに両プロトプラストからの再分化系を確立した。両プロトプラストの細胞融合による雑種作出に際し融合細胞の効率的な選抜を行うために、アグロバクテリウム法とレーザー法によりハイグロマイシン耐性遺伝子とビアラフォス耐性遺伝子を導入した形質転換体の作出を試みた。現在までアグロバクテリウム法によりビアラフォス耐性遺伝子を導入したメロンの形質転換体を得た。

Research Products

• [Publications] 尾崎武司: "N_2レーザーマイクロビームによる植物細胞への直接遺伝子導入" 植物組織培養. 12. 73-78 (1995)
• [Publications] 尾崎武司: "メロンと同属異種野性植物Cucumis figareiに含まれる 抗ウイルス活性物質の部分精製と作用機構" Appl.Biol.Sci.1. 41-52 (1995)
• [Publications] Yonaha,T.: "Pepper vein yellows virus,a novel luteo virus from bell pepper plants in Japan" Ann.Phytopath Soc Japan. 61. 178-184 (1995)
• [Publications] 尾崎武司: "ヒガンバナ 科および ユリ科球根花卉類のりん 葉切片からの 子球形成とウイルス 無毒化" 植物組織培養. 13(印刷中). (1996)
• [Publications] Yanagawa,T.: "In vitro propagation and elimination of virus by bulb scale cultures of Hippeastrum bulbs" Plant Tissue Culture Letter. 13(印刷中). (1996)
• [Publications] 尾崎武司: "植物病理学事典" 養賢堂, 1220 (1995)
• [Publications] 大木理: "植物病理学事典" 養賢堂, 1220 (1995)