DNA組換えによる虚血耐性獲得と応用した長時間心保存法の確立に関する研究

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06404047
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 松田 暉 大阪大学, 医学部, 教授 (00028614)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金田 安史 大阪大学, 細胞生体工学センター, 助教授 ; 澤 芳樹 大阪大学, 医学部, 助手 (00243220) ; 谷口 和博 大阪大学, 医学部, 助手 (90171842) ; 白倉 良太 大阪大学, 医学部, 教授 (00116047)
• Keywords: 遺伝子導入 / 心保存法 / ストレス蛋白 / HVJ-liposome法 / 心筋虚血耐性

Research Abstract

本研究の最終目的は、DNA組み換え技術を応用して、心保存中にHVJ(Hemagglutinating Virus of Japan)-liposome法を用いてHeat Shock Protein 70高度発現のためのtransfectionを行い、虚血心筋においてHeat Shock Protein 70の発現,活性を増強し、それにより心筋虚血耐性を獲得させ長時間の安全な心保存法を確立することである。現在までそれにいたるstepとして以下の実験系を確立させた。
1)DNA組み換えによるHSP70のcDNA作成
2)HSP70のcDNAを発現vecter(pcDNA3)へ導入、精製
3)in vitroの実験系
rat心から心筋細胞、冠血管内皮細胞をそれぞれ単離培養し、それぞれの細胞に対しHVJ-liposome法を用いてHSP70のDNAを導入し、高度のHSP70が発現することをImmunohistochemical study及びWestern blottingにて確認した。さらにHSP70を過剰発現させた心筋細胞では虚血再灌流モデルにおいてATP depletionが有意に少ないこと、CKの漏出が有意に少ないことが示された。transfectionされた冠血管内皮細胞においても虚血によるATP depletionが有意に少ないこと、FITC-albuminの漏出が有意に少ないことが示された。
4)in vivoの実験系
rat心に冠動脈より心全体に行き渡るようにHSP70 geneを含むHVJ-lipospmeを注入し同種同系のratの腹部に移植し、蛋白発現を待ち測定を行ったところ Immunohistchemical study Western blottingにおいて心全体にHSP70の過剰発現を認め、その心はLangendorff perfusionを用いた虚血再灌流障害において有意な耐性獲得を示した。
すなわちin vitro,in vivoの療法の系においてHVJ-liposome法をもちいた効率のよいtransfectionの方法を確立し、それによりin vivo, in vitroの両面からHSP70の心筋虚血再灌流障害における保護効果の確認ができた。