1994 Fiscal Year Annual Research Report
肝・骨・腎型アルカリホスファターゼの転写及び生合成と骨代謝
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06404065
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
織田 公光 新潟大学, 歯学部, 教授 (10122681)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
五十嵐 敦子 新潟大学, 歯学部, 教務職員 (90168097)
高橋 徳也 新潟大学, 歯学部, 助教授 (50018420)
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| Keywords | 骨アルカリホスファターゼ / GPIアンカー / 膜結合型酵素 / キメラ蛋白質 / トランスフェクション |
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| Research Abstract |
1.人肝/骨/腎型アルカリホスファターゼ(ALP)及びラットALPに対する特異的坑体を調製するためにALPのアミノ酸配列のhydropathy plotから親水性と思われる領域を2箇所(40-50アミノ酸残基)選び、cDNAを鋳型に合成プライマーを用いてPCR法により増幅後、T7BlueTベクター(Novergen)にクローニングした。増幅したDNAフラグメントの塩基配列が予想されたものと同一であることを確認した後、BamHIとEcoRIでDNAフラグメントを切り出した。次に、あらかじめBamHIとEcoRIで処理しておいたpGEX-2T(Pharmacia)にサブクローニングを行なった。pGEX-2Tでトランスフォームした大腸菌(DH5α)をIPTGの存在下に大量培養し、2種類のALPのペプチドをglutathione-S-transferaseの融合蛋白として発現させた。融合蛋白は大腸菌を超音波処理後遠心して得られた上清画分からglutathione-Sepharoseカラムを用いたアフィニテイークロマトグラフィーにより精製、家兎に免疫した。現在、ALPのcDNAでトランスフェクトしたCOS-1細胞および人のOsteosarcoma由来のSaos-2細胞を用いて坑体の特異性を検討している。
2.人肝/骨/腎型アルカリホスファターゼは形質膜を貫通しているのではなく翻訳後に特殊な修飾(glycosylphosphatidylinositol;GPI)を受ける結果、形質膜の脂質二重層の外層にGPIを介してアンカーされていることが知られている。そこで、可溶性の蛋白質であるラットのα2u-globulinにALPのC-末端側の延長ペプチドを融合させたキメラ蛋白を発現するプラスミドを遺伝子工学的な手法を用いて構築した。現在本プラスミドがGPI結合型蛋白として細胞表面に発現するかいなか検討中である。
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