微生物のアミン・アミノ酸代謝酵素の構造と機能に関する研究 -応用を目指して

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06453168
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 熊谷 英彦 京都大学, 農学部, 教授 (70027192)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 玉置 尚徳 京都大学, 農学部, 助手 (20212045) ; 鈴木 秀之 京都大学, 農学部, 助手 (10202136) ; 山本 憲二 京都大学, 農学部, 助教授 (70109049)
• Keywords: チロシンフェノールリアーゼ / アミン酸化酵素 / γ-グルタミルトランスペプチダーゼ / X線結晶解析 / グルタチオンS-トランスフェラーゼ

Research Abstract

(1)L-DOPAの生産の利用されているErwinia herbicolaのチロシンフェノールリアーゼ(TPL)について大腸菌での大量発現系の構築を試み、T7ファージのプロモータ及びRNAポリメラーゼによる発現系で高発現を達成した。ただしアポ酵素の状態での発現であり、今後ホロ酵素の高発現を検討する必要がある。同菌TPLのX線結晶構造解析を進めた。ホロ酵素の結晶を得、X線照射したところ大変よい回折像を与えることが明らかになった。
(2)γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)結晶のデータに基づいて、高分解能電子密度モデルの作成、重元素同型置換体の作成を行った。主鎖構造の立体モデルを作成することに成功している。さらに、もう一種の重元素同形置換体を得ることが必要であるので、変異酵素Ser33Cysを作成し、そのPCMB複合体の結晶化を行った。
(3)高純度グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を調製し、結晶化の条件を検討したが、X線構造解析に適した結晶は得られていない。X線構造解析に適した結晶条件をさらに検討している。他に結晶化に適したGSTアイソザイムを得ることを目的として、酵母Issachenkia orientalisのGST Y1cDNAのクローニングを行った。
(4)大腸菌アミン酸化酵素(AO)について活性発現に必須な銅原子の分子内リガンドと考えられるヒスチジン残基について点突然変異酵素を作製し銅やTPQ含量を解析し、論文 として報告した。これとは別に、かびAspergillus nigerのAOについてもcDNAクローニングを行いその一次構造を明らかにし、論文として報告した。

Research Products

• [Publications] Ivo Frebort, et al: "Two distinct quinoprotein amine oxidases are induced by n-butylamine in mycelia of Aspergillus niger AKU 3302." Eur. J. Biochem.,. (in press). (1996)
• [Publications] Hideyuki Suzuki, et al: "Transcriptional regulation of tyrosine phenol lyase gene of Erwinia herbicola AJ2985." Biosci. Biotech. Biochem.59. 2339-2341 (1995)
• [Publications] Jung-Hyeob Rob,et al: "Escherichia coli K-12 copper-containing monoamine oxidase:" Biochem. Biophys. Res. Commun.212. 1107-1114 (1995)