不死化されたプリオンレス神経細胞を用いてのプリオンの機能解析

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06454128
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小野寺 節 東京大学, 農学部, 教授 (90012781)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 安喜 東京大学, 農学部, 助手 (90251420) ; 松本 芳嗣 東京大学, 農学部, 助教授 (00173922)
• Keywords: プリオン / ジーンターゲッティング / 海綿状脳症 / スクレイピ- / 痴呆症 / スローウイルス / ク-ル- / 細胞不死化

Research Abstract

プリオンレス胎令14日目の脳海馬より細胞を分離し、一晩10%FCSを含むDMEMにより培養した。その後、培養細胞に組み換えウイルスを感染させ、不死化遺伝子をトランスフェクトした。2週間後に神経細胞の形態をしたコロニーを分離し、限界希釈によりクローニングした。株化した細胞についてdcAMPに対する反応性、プリオン遺伝子の有無、免疫化学による性状を検索した。
以上のジーンターゲッティングにより得たプリオンレスマウスの脳より不死化操作により細胞株を得た。これらの細胞に対しプリオン遺伝子ORFに対するPCRを行ったところ陰性であった。一方グリア蛋白遺伝子(GADPH)に対するPCRを行ったところ陽性であった。いくつかの株はグリア線維(GFAP)染色で陽性を示した。またいくつかの細胞株はdcAMPの培地添加により反応性を示したが、GFAPおよびneurofilament染色については陰性であるため、神経細胞の幹細胞と考えられた。
ジーンターゲッティングによりプリオンレスマウスが得られたが、文献的にはORFよりさらに上流のエクソン1、エクソン2のマウス遺伝子がクローニングされている為、これらの部分の機能検索が必要とされる。またプリオン蛋白はGABAを介した神経伝達に重要な働きをしているとの報告が最近のNatureに他の研究グループの報告に見られる。したがって不死化プリオンレス神経細胞を用いた研究の重要性は高まったと考えられる。

Research Products

• [Publications] Onodera T.,他: "Diversity of clinical sign in natural scrapie cases in Japan." Jpn. Agri. Res. Quart.28. 59-61 (1994)
• [Publications] 佐伯 圭一,他: "ラット不死化神経細胞株およびラットにおけるプリオン蛋白のcDNAのクローニングと遺伝子発現の解析" 家畜生化学. 31. 37-43 (1994)
• [Publications] 小野寺 節: "牛海綿状脳症のその後について" モダンメディア. 41. 60-68 (1995)
• [Publications] 小野寺 節: "近代出版(山内一也、立石潤、編)" スローウイルス感染とプリオン, 300(25) (1994)