メイラード反応後期生成物に対する細胞膜レセプターの構造と機能

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06454170
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 堀内 正公 熊本大学, 医学部, 教授 (10117377)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒木 令江 熊本大学, 医学部, 助手 (80253722)
• Keywords: メイラード反応後期生成物(AGE) / マクロファージ / AGEレセプター / スカベンジャーレセプター / グリケーション / 糖尿病 / 老化

Research Abstract

多くの生体蛋白質が非酵素的に糖付加反応(メイラード反応)を受けている。特にその後期反応生成物(Advanced Glycation End products:AGEと以下略す)を特異的に認識する細胞膜レセプター(AGEレセプター)は、AGEの老化現象あるいは糖尿病合併症の病態への関与を解く重要な糸口として注目されている。AGEレセプターの構造と機能の解明を目的として、平成6年度はAGEレセプターの分子構造を中心に解析した。
1、AGEレセプタータンパク質の単離本レセプターがヒト、牛、ラット、及びマウスマクロファージ(Mφ)系細胞の各細胞膜上に発現する事を確認した。特に結合活性を高く示すラットMφの膜可溶化画分より、AGE-BSAアフィニティーカラム、MonoQ、MonoS-FPLCを用いてAGEに結合性の分子量90K,48K,28K,及び18Kの4種のタンパク質を精製した。それぞれのN末端部アミノ酸配列は、バロシン含有タンパク質(90K)、チトクロームP450IID(48K)、ヒストンH28.1(18K)と同一であった。28Kタンパク質に関してはN末端部が修飾を受けていたので、現在解析中である。
2、AGEレセプターのExpression CloningマウスMφ(Raw264.7)より作成したcDNAライブラリーをpcDNAベクターに組み込み、COS細胞に形質導入させた。AGEに結合活性を有する細胞群を分画し、そのプラスミドcDNAを大腸菌で増幅して解析したところ、約6.0Kbのインサートをもつプラスミドが有意に検出された。現在このcDNAの解析を進めている。
3、AGEレセプター欠損(変異)細胞の単離AGE-BSAに毒タンパク質リシンA鎖を結合させ、変異原で前処理したRaw細胞に添加した後、生存し得た細胞を最終的に約8コロニー選択した。現在これらの細胞のリガンドに対する取り込み分解活性を検討している。
4、結合反応を特異的に阻害するモノクローナル抗体の開発Raw細胞を抗原としてラットを免疫し、AGEとMφの取り込み分解反応を阻害する抗血清を得た。定法によって、本ラットの脾細胞とマウスミエローマ細胞の融合細胞を調製し、スクリーニングにより、Raw細胞のAGE取り込み分解活性を有意に阻害する抗体産生クローンを7株得た。現在、これらのクローンのサブスクリーンニングと、抗体の特異性を解析している。この抗体は上記の両アッセイ系のプローブのみならず、来年度に予定しているAGEレセプター機能解析においても有効であると考えられる。

Research Products

• [Publications] Norie Araki: "Macrophage scavenger receptor mediates endocytic uptake of advanced glycation end products of the Maillard reaction." Eur.J.Biochem.(in press). (1995)
• [Publications] Makino,H.: "Ultrastructure of nonenzymatically glycated mesangial matrix in diabetic nephropathy." Kidney Int.(in press). (1995)
• [Publications] Kume,S.: "Immunohistochemical and ultrastructural detection of advanced glycation end products atherosclerotic lesions of human aorta using a novel specific monoclonal antibody." Am.J.Pathol. (in press). (1995)
• [Publications] Yamada,K.: "Immunohistochemical study of human advanced glycosylation end products(AGE)in chronic renal failure." Clin.Nephrol.42. 354-361 (1994)
• [Publications] Horiuchi,S.: "Advanced glycation end productsof the Maillard reaction and their relation to aging." Gerontology. 40. 10-15 (1994)
• [Publications] Yui S.: "Induction of macrophage growth by advanced glycation end products of the Maillard reaction." J.Immunol.152. 1943-1949 (1994)
• [Publications] Seikoh Horiuchi: "“Maillard reactions in chemistry,food,and health"" The Royal Society of Chemistry, 5 (1994)
• [Publications] 荒木令江: "糖尿病記録号 日本糖尿病学会編" 医学図書出版(in press), (1995)