アンチセンスDNAを用いたウイルス肝炎の遺伝子治療の基礎的研究

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06454262
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 林 紀夫 大阪大学, 医学部, 講師 (00144478)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 萩原 秀紀 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 三田 英治 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 竹原 徹郎 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 笠原 彰紀 大阪大学, 医学部, 助手 (70214286)
• Keywords: in vitro遺伝子導入 / in vivo遺伝子導入 / アシアロ糖タンパク / 陽電荷リポソーム / クロロキン / carrier-DNA比 / 遺伝子治療 / 肝特異的遺伝子導入

Research Abstract

「アシアロ糖タンパク法によるin vitroおよびin vi vo遺伝子導入」
1)アシアロ糖タンパク法ではpoly-L-lysineを架橋し精製したものをcarrierとしたcarrier-DNA complexを作製するが、in vitroおよびin vivoでの遺伝子導入効率をcarrier-DNA比を変えて検討した。その結果、肝癌由来の細胞株であるHepG2を用いたin vitroの系では、carrier-DNA比が480:1の場合に最も高い遺伝子導入効率を示した。従来の行われているようなgel retardation assayで決定する効率に比べ約10倍も導入効率は高かった。
2)lysosomal enzyme inhibitorであるクロロキンを添加した場合の導入効率への影響の解析した。in vitroでのクロロキンによる遺伝子導入効率に及ぼす影響を検討したところ、50mMのクロロキンは無添加時に比べ22倍効率を増加させた。その結果、50mMのクロロキン存在下ではHepG2細胞の約3.0%に導入遺伝子の発現を認めた。
3)マウスへのin vivoにおける遺伝子導入を^<32>P標識したDNAを用い検討したところ、尾静脈からの静注10分後の時点ですでに85%以上が肝臓に集積していた。また、carrier-^<35>S標識DNAを静注後の肝組織でのmicroautoradiographyではcomplexが肝細胞に特異的に集積していた。
4)in vivoにおける投与経路と導入効率の差異をマウスを使って検討した。投与経路として尾静脈より投与する方法と開腹下に門脈より投与する方法を検討した。その結果、経静脈的に比べ経門脈的に投与した方が有意に高い導入効率を示した。
「陽電荷リポソーム法によるin vitroおよびin vivo遺伝子導入」
5)陽電荷リポソームを用いた遺伝子導入法も検討した。陽電荷リポソームを用いた肝臓への導入法は従来経門脈的もしくは直接肝臓に注入する方法がとられていたが、経胆管的な導入効率を解析した。陽電荷リポソーム-DNA complexをラットの胆管より逆行性に肝内に注入し、胆管を90分間結紮後これを解除する方法を用いたところ、遺伝子発現が1日目から1週間後まで観察された。
6)陽電荷リポソーム法の遺伝子発現は胆管上皮には認められず、肝細胞にのみ観察された。

Research Products

• [Publications] Takehara T,et al.: "Expression of the hepatitis C virus genome in rat liver after cationic liposome-mediated in vivo gene transfer." Hepatology. 21. 746-751 (1995)
• [Publications] Yamamoto M,et al.: "In vivo transfection of the hepatitis C virus complementary DNA into rodent liver by asialoglycoprotein receptor mediated gene transfer." Hepatology. 22. 847-855 (1995)
• [Publications] Naito M,et al.: "Serum hepatitis C virus RNA quantity and histological features of hepatitis C virus carriers with persistently normal ALT levels." Hepatology. 19. 871-875 (1994)
• [Publications] Suzuki K,et al.: "Expression of the c-met protooncogene in human hepatocellular carcinoma." Hepatology. 20. 1231-1236 (1994)
• [Publications] Moribe T,et al.: "Hepatitis C viral complexity detected by single-strand conformation polymorphism and response to interferon therapy." Gestroenterology. 108. 789-795 (1995)
• [Publications] Hiramatsu N,et al.: "Immunohistochemical detection of Fas antigen in liver tissue of patients with chronic hepatitis C." Hepatology. 19. 1354-1359 (1994)