心筋細胞内プロテインキナーゼCとカルシウムのクロストーク: 細胞内分布の可視化

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06454291
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 木原 康樹 京都大学, 医学研究科, 助手 (40214853)
• Keywords: カルシウム / 筋収縮 / プロテインキナーゼC / 分子生物学 / 心筋細胞

Research Abstract

プロテインキナーゼ(PK)Cは、細胞の増殖、収縮、遺伝子発見など多彩な細胞内プロセスに関与していると考えられるが、心筋細胞におけるPKCの作用については未だ明確な位置付けが得られていない。特にCa^<2+>とPKCとの相互共役が、心筋細胞内におけるCa^<2+>を主体とする秒単位の急速反応系と、PKCなどによる慢性反応系との関連を複雑かつ不明瞭にしている。本研究において我々は、蛍光指標の応用により、PKCの細胞内局在・活性化、転座の過程と、細胞内Ca^<2+>濃度分布の変化が、同一心筋細胞内にて観察できるシステムの開発を試みた。
雄Wisterラットより左室心筋細胞を単離した。1)細胞内Ca^<2+>蛍光指標Indo-1の負荷とCa^<2+>測定: 心筋細胞をカバーグラス上に散布し、Tyrode溶液にて表在灌流した。Indo-1は10μM acetoxymetyl exter(AM)型として5-10分間灌流して細胞内へ負荷した。カ-ルツァイサ-社LSM410倒立型共焦点レーザースキャン顕微鏡を用い、その蛍光405±10mmにて同期フィルターを用いて検出し良好な信号が得られた。2)PKC蛍光プローブの導入: 同様に設定した単離心筋細胞を22℃にて100nM PKCプローブ、12-(1, 3, 5, 7-tetramethyl-BODIPY-2-propionyl)phorbol-13-acetate(Molecular Probes社)を含むTyrode液にて10-60sec表在灌流した。同フォルボールアナログの投与により心筋は過収縮状態となるため、クロスブリッジを抑制するBDMの前投与を行った。プローブに対する投光は485±5nmにて行い、その蛍光は530mnのlong-passでフィルターで検出を試みているが未だ至適投与量の確立に至っていない。今後共研究を続行する。

Research Products

• [Publications] Kihara Y, Sasayama S, Inoko M, Morgan JP.: "Sodium/Calcium exchange modulates intracellular calcium overload during posthypoxic reoxygenation in mammalian working myocardium: evidence from aequorin-loaded ferret ferret ventricular muscles." J. Clin. Invest. 93. 1275-1284 (1994)
• [Publications] Kihara Y, Sasayama S.: "1-Methionine augments myocardial contraction by sensitizing myofilament for calcium." Circ. Res. 77. 80-87 (1995)
• [Publications] Sasayama S, Asanoi H, Kihara Y, Yokawa S, et al.: "Clinical effects of long-term administration of pimobendan in patients with moderate congestive heart failure." Heart and Vessels. 9. 133-120 (1994)
• [Publications] Kihara Y, Inoko M, Hatakeyama N, et al.: "Mechanisms of negative inotropic effects of class Ic antiarrhythmic agents: comparative sutdy of the effects of flecainide and pilsicainide on intracellular calcium handling in the dog ventricular myocardium" J. Cardiovasc. Pharmacolog.27. 42-51 (1996)
• [Publications] Inoko M, Kihara Y, Fujiwara H, Sasayama S.: "Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats." Am. J. Physiol. 267. H2471-H2482 (1994)
• [Publications] Inoko M, Kihara Y, Sasayama S.: "Neurohumoral factors during transition from left ventricular hypertrophy to failure in Dahl salt sensitive rats." Biochem. Biophys. Res. Commun.206. 814-820 (1995)
• [Publications] Sasayama S, Asanoi H, et al.: "Diastolic Relaxation of The Heart, 2nd Edition, Kluwer Academic Publishers" Grossman W and Lorell BH, des., 8 (1994)
• [Publications] Kihara Y, Sasayama S: "Proceedings of Oji International Seminar on the Pathophysiological Roles of Intracellular Calcium Ion." Kusuoka H and Marban E, eds., 5 (1994)