透明帯蛋白質に結合する精子リガンド分子の性状分析と遺伝子クローニング

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06454481
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 香山 浩二 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (00068496)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小森 慎二 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (60195865) ; 山崎 則行 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (50174644) ; 長谷川 昭子 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (50212402)
• Keywords: 受精 / 卵透明帯 / 精子リガンド / ブタ透明帯エピトープ / ブタZP1 / プロアクロシン / 避妊ワクチン

Research Abstract

哺乳動物の受精メカニズムを明らかにするため、天然材料から大量に精製することが困難な卵透明帯タンパクを遺伝子組換え体として合成し、精子との反応を検討した。pZP1(ブタ透明帯成分)のアミノ末端から198アミノ酸残基をコードする遺伝子を発現ベクターpET21bに組み込み、リコンビナントpZP1(r-pZP1)を合成した。イオノフォアA23187で先体反応を誘起した精子にr-pZP1を添加し1〜18時間培養すると、反応時間の経過に伴い、このタンパクと反応する精子の割合が増加した。また、pZP1の精子との結合部位は、最初は赤道面のみであったが、次第に後帽部と尾部に反応する精子が増加した。イオノフォアで先体反応を誘起しない精子はr-PZP1と反応しなかった。また、卵丘細胞と共に培養した精子においてもr-pZP1との陽性反応が観察された。pZP1の活性部位と推定されるアミノ酸番号50-67に対応する18mer合成ペプチドを用いても同様の精子への結合性が確認された。隣接する配列(アミノ酸番号60-79)の合成ペプチドには、精子との結合は見出されなかった。
次に、r-pZP1と反応する精子側リガンド分子の同定を試みた。ブタ精子から粗抽出した分画をSDS-PAGEで分離し、r-pZP1との結合を調べた。r-pZP1は40K成分と強く反応し、また60K成分とも反応した。これらの成分のアミノ末端アミノ酸配列(10サイクル)を調べた結果、60K成分からはVVGGMSAQHGの配列が、また40K成分からはSDVFTQYIGDの配列が得られた。ホモロジーサーチの結果、60Kの配列はブタ精子のプロアクロシンβ-chainの配列と完全に一致したが、40Kの配列には該当する配列はなかった。今後40Kについて、遺伝子のクローニングも含めた物質の同定を行う予定である。

Research Products

• [Publications] Koji Koyama: "Peptide mapping and cDNA cloning for a glycoprotein(pZP4)of porcine zona pellucida" Advances in Contraceptive Delivery Systems. 10. 235-253 (1994)
• [Publications] Akiko Hasegawa: "Amino acid sequbnce of a porcine zora pellucida glycoprotein ZP4 determined by peptide mappimg and CDNA cloning" Journal of Reproduction and Fertility. 100. 245-255 (1994)
• [Publications] 長谷川 昭子: "卵透明帯の生合成部位と発現時期に関する免疫組織学的研究" 哺乳動物卵子学会誌. 11. 239-246 (1994)