唾液腺癌浸潤増殖による間質改造現象における基底膜分子とその分解酵素群の動態

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06454508
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 朔 敬 新潟大学, 歯学部, 教授 (40145264)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 織田 公光 新潟大学, 歯学部, 教授 (10122681) ; 木村 信 新潟大学, 歯学部, 助手 (80251825) ; 程 くん 新潟大学, 歯学部, 助手 (40207460) ; 福島 祥紘 新潟大学, 歯学部, 助教授 (00018631)
• Keywords: 腺様嚢胞癌 / ACC2 / ACC3 / 基底膜 / 共焦点レーザ顕微鏡 / ヘパラン硫酸プロテオグリカン / ヘパラナーゼ / コラゲナーゼ

Research Abstract

本年度は以下の実験をおこない、培養唾液腺腺様嚢胞癌細胞が自ら基底膜分子を生合成して細胞外に沈着し、かつ自身の分解酵素によってこれを改造していることを示唆する所見をみいだした。
(1)細胞培養:ヒト腺様嚢胞癌由来株細胞ACC2及びACC3を35mmペトリ皿または24穴マイクロプレート上で単層培養し、^<35>S-硫酸と^3H-ロイシンによる標識を行った。
(2)免疫染色:単層培養細胞は、培養開始後24時間毎に固定し、免疫染色をおこなった。培養細胞は同様に固定後、ショ糖氷晶防止処理後、凍結超薄切片も作製した。切片はI型コラゲンと四種の基底膜分子:IV型コラゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンのウサギ抗体と、ヘパリチナーゼ、ヘパラナーゼ、カテプシンD、コラゲナーゼ(MMP9)のマウス抗体,さらにコロイド金またはロ-ダミン標識二次抗体を用いて染色をおこなった。
(3)共焦点レーザ顕微鏡による観察:前記2)のとおりに作製された標本を共焦点レーザ顕微鏡で、断層撮像を三次元再構築し、立体的に細胞内外の分子移動を観察した。細胞内での基底膜分子の生合成開始と同時に細胞質内に酵素の発現がみられ、基底膜分子の細胞外沈着開始後に酵素群も細胞外空間に放出されていることが確認された。
(4)凍結超薄切片法による免疫電顕的観察:前記2)のとおり氷晶防止された試料は、超低温凍結固定し、凍結超ミクロトームで凍結切片を作製し、間接金コロイド法で免疫染色、電子顕微鏡で観察した。細胞内小胞に基底膜分子と酵素が局在することが判明した。小胞は合成から分泌までの経過にあるものと、細胞外の基質分子が飲み込まれたのち、分解過程にあるものがみいだされた。いずれの過程でも多胞小体、水解小体が関与するようであることが判明した。
(5)細胞ならびに培地中基底膜分子分解産物の追跡:免疫染色の標本採取時期に準じて、細胞と培地をそれぞれ採取し、各抗体をもちいて免疫沈降反応によって回収し、電気泳動後フルオログラフィによって可視化した。培地中には、標識後3時間でヘパラン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質に相当する蛋白質と、約300kDaのその分解物と考えられるペプチドが出現した。これは硫酸基を有していなかった。また、培地及び細胞可溶化物のゼラチンザイモグラフィによってMMP2およびMMP9がACC3細胞から放出されていることが判明した。

Research Products

• [Publications] Yoshizawa M,et al.: "Histopathological study on lymphatic invasion in squamous cell carcinoma (O-IN) with high potential of lymph node metastasis." Clinical & Experimental Metastasis. 12. 347-56 (1994)
• [Publications] Cheng J,et al.: "Heparan sulfate proteoglycan turnover in adenoid cystic carcinoma of salivary gland" Proceedings of 7th Meeting of IAOP. 27- (1994)
• [Publications] Oda K,et al.: "Conversion of secretory prpteins into membrane proteines by fusing with a glycosylphosphatidylinositol anchor signal of alkaline phosphatase" Biochemical Journal. 310. 577-83 (1994)
• [Publications] Kobayashi Y,et al.: "Loss of basement membranes in the invading fron of O-IN,hamster squamous cell carcinoma with highly lymph node metastatic potential: an immunohistochemical study for laminin and type IV collagen." Pathology International. 45. 327-34 (1995)
• [Publications] Cheng J,et al.: "Biosynthesis of basement membrane molecules by salivary adenoid cystic carcinoma cells: an immunofluorescence and confocal microscopic study" Virchows Archiv. 426. 577-86 (1995)
• [Publications] Kimura S,et al.: "Biosynthesis and secretory pathway of basement membrane molecules in salivary adenoid cystic carcinoma cells." Abstracts of 4th International Congress on Oral Cancer. 74- (1995)