1995 Fiscal Year Annual Research Report
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06454652
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| Research Institution | TOKYO INSTITUTE OF TECHNOLOGY |
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Principal Investigator |
金保 安則 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (00214437)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 勝宣 国立精神神経センター神経研究所, 疾病研究室, 主任研究員 (40183850)
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| Keywords | ホスホリパーゼD / 低分子量GTP結合蛋白質 / ADPリボシル化因子 / RhoA / C3酵素 / ADPリボシル化 |
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| Research Abstract |
今までに、ホスホリパーゼD(PLD)の活性化因子として分子量GTP結合蛋白質のADPリボシル化因子(ARF)が同定されたが、平成6年度に、申請者は、Ca^<2+>結合蛋白質のカルモジュリン(CaM)がARFによるPLDの活性化を促進することを報告した。これに続いて、平成7年度には、ARFとは異なる低分子量GTP結合蛋白質のRhoAもラット大脳膜結合性PLDを活性化するという興味ある以下の知見を得た。
RhoAによるラット大脳膜結合性PLDの活性化:55-75%飽和硫酸アンモニウムで沈殿したウシ大脳細胞質蛋白質をDEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィで分画すると、ARFは未吸着画分に溶出された。これらの画分をラット大脳膜画分から部分精製したPLDと再構成したところ、報告どうりARFを含有する未吸着画分は、GTP非水解性アナログのGTPγS存在下でPLDを活性化したが、約60mM NaClで溶出される画分にもGTPγS存在下でPLDを活性化する活性が認められた。この画分にはARFは検出されず、ボツリヌス毒素が産生するC3酵素によりADPリボシル化される22 kDaの蛋白質が存在していた。このPLD活性化因子をPhenyl Sepharose CL-4B、TSK-GEL 3000 SW XL、Mono Qカラムクロマトグラフィーでさらに精製したところ、これらのカラムクロマトグラフィーにおいてPLD促進活性とC3酵素基質の両者はほぼ同じ位置に溶出された。この精製されたPLD活性化因子標品中に存在する低分子量GTP結合蛋白質をWestern Blottingで解析したところ、RhoAが検出された。そこで、Sf9細胞で発現させ精製したRhoAを部分精製PLD標品と再構成したところ、PLDはRhoAの濃度依存的に活性化された。これらの結果から、RhoAもPLD活性化因子であることが結論づけられる。さらに、ARFとRhoAは、ラット大脳PLDを相乗的に活性化することも明らかになった。
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[Publications] Hiroshi Nishina: "Significance of Thr182 in the nucleotide-exchange and GTP-hydrolysis reactions of the α subunit of GTP-binding protein Gi2" J. Biochem. (Tokyo). 118. 1083-1089 (1995)
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[Publications] Tomohiko Maehama: "NAD^+-dependent ADP-ribosylation of T lymphocyte alloantigen RT6.1 reversibly proceeding in intact rat lymphocytes" J. Biol. Chem.270. 22747-22751 (1995)
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[Publications] Hideo Kuribara: "Synergistic activation of rat brain phospholipase D by ADP-ribosylation factor and rhoA p21, and its inhibition by clostridium botulinum C3 exoenzyme" J. Biol. Chem.43. 25667-25671 (1995)
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[Publications] Koh-ichi Takahashi: "Synergistic stimulation of phospholipase D by calmodulin and ADP-ribosylation factor in permeabilized rabbit peritoneal neutrophils" J. Immunol.156. 1229-1234 (1996)
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[Publications] Takeaki Yokozeki: "Partially purified RhoA-stimulated phospholipase D activity specifically binds to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate" J. Neurochem.(in press). (1996)
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[Publications] Yasunori Kanaho: "Regulation of phospholipase D by low molecular weight GTP-binding proteins" L. Lipid. Medi. Cell Signal.(in press). (1996)
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[Publications] 金保 安則: "実験医学:GTP結合蛋白質" 羊土社, 311 (1996)
