蛋白工学とクライオ電子顕微鏡を用いた分子立体構造に基づく蛋白質モーター機構の研究

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06454663
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 若林 健之 東京大学, 大学院理学系研究所, 教授 (90011717)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安永 卓生 東京大学, 大学院理学系研究科, 助手 (60251394)
• Keywords: アクチン / ミオシン / クライオ電子顕微鏡 / 画像解析 / カルシウム / 筋収縮 / 蛋白質工学 / トロポミオシン

Research Abstract

ディクチオ型粘菌の遺伝子操作により、ミオシン重鎖のN端近傍(Asp5)にシステインを導入し、金原子クラスター(Au_<11>)を標識し、その位置をクライオ電子顕微鏡法によって三次元的に決定することができた。現在はアクチン遺伝子を改変してシステインを特定の部位に導入することを目的として、まず、現存のアクチン分子にある反応性システイン(Cys374)をアラニンに変えた改変アクチンを精製し、マレイミド試薬にほとんど反応しない事を確認している。この改変遺伝子に、新たに反応性システインを導入し、改変アクチンを精製している。高角傾斜が可能な対物レンズが導入され、現在その振る舞いを吟味している。同レンズ用の試料汚染防止装置も組み込み、その効果についても吟味している。同装置はビーム位置の安定性を損なう恐れもあり、特にこの点について詳しく検討する。高角傾斜像シリーズ(60度まで)を基準参照点を利用してアラインするプログラムは完成した。アクチンを改変して、トロポミオシン結合部位が変わる部位を新しく1ヶ所見い出した。すでに見つけたものと併せて3ヶ所となったので、トロポミオシン結合部位を推定できるようになった。アクチン・トロポミオシン・トロポニン複合体の構造を、Caイオンの有無で比較し、有意な構造変化を捉えることに成功した。

Research Products

• [Publications] Ishikawa,T.& Wakabayashi,T.: "Proposal of alignment-independent classification of electron microscopic images with helical symmetry and its application to reconstituted thin filaments of skeletal muscle" Ultramicroscopy. 57. 91-101 (1995)
• [Publications] Ishikawa,T.& Wakabayashi,T.: "Calcium Induced Change in Three-dimensional Structure of Thin Filaments of Rabbit Skeletal Muscle as Revealed by Cryo-electron Microscopy" Biochem.Biophys.Res.Commun.203. 951-958 (1994)
• [Publications] Kikkawa,M.,et al.: "Direct Visualization of the Microtubule Lattice Seam both in vitro and in vivo" J.Cell Biol.127. 1965-1971 (1994)