2光子励起レーザー走査型共焦点顕微鏡の開発と細胞内Ca^<2+>測定への応用

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06557003
• Research Institution: 佐賀医科大学
• Principal Investigator: 久場 健司 佐賀医科大学, 医学部, 教授 (60080561)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 能見 光雄 佐賀医科大学, 医学部, 助教授 (80117209)
• Keywords: 2光子励起 / 起短パルスレーザー / 細胞内Ca^<2+> / ニューロン / インド-1 / チタンサファイアレーザー / 運動神経終末 / 蛍光測定

Research Abstract

(1)システムの構築:高出力アルゴンレーザー、チタンサファイア超短パルスレーザー、半導体レーザー、多数の光学部品(フィルター、光路切換え装置等)、レーザー走査及び測光装置、倒立顕微鏡による全システムの設計と製作が完了し、更に超短パルスレーザーの標準発振波長760nmより以下の690nmでの発振の為の改良が終了した。
(2)二光子励起上最も問題となるのは、超短パルスレーザーが対物レンズ及びその他の光路の透過時に分散が起るために、そのパルス幅が延長することであるが、この問題を解決するために、顕微鏡の光路延長用の平面ガラス(40mm)を除き、対物レンズでの分散を測定する装置を設計製作した。
(3)可視光レーザーによる走査装置と顕微鏡の光軸の調整を行い、蛍光ビーズによる画像取得のテストが終了した。
(4)超短パルスレーザー(760nm,140fsec)による2光子励起により、蛍光物質を塗布した紙の線維のイメージを記録し、2光子励起の起るレーザーの強さに閾値が存在すること、さらに、2光子励起の効率はNIKONの20XCF Fluor (N.A.,0.75)と40X CF Fluor (N.A.,0.85)を比較すると前者が高いことが解った。
(5)シナプス前末端の[Ca^<2+>]_1測定に関して:運動神経終末や、交感神経節シナプス前線維終末に拡散法によるCa^<2+>感受性蛍光プローブを負荷させる方法を確立し、倒立顕微鏡による蛍光測定法を開発した。
(6)新しい細胞内Ca^<2+>遊離機構に関して:脳組織内では細胞外空間のCa^<2+>量は有限であることから、この量の減少による細胞内Ca^<2+>遊離機構の活性化という“容量性Ca^<2+>遊離"の概念を提唱した。

Research Products

• [Publications] Yoshizaki,K.: "Ca^<2+>-induced Ca^<2+> release and its activation in response to a single action potential in rabbit otic ganglion cells." J.Physiol.(Lond.). 486. 177-187 (1995)
• [Publications] Hua,S.-Y.: "Cyclic ADP-ribose Modulates Ca^<2+> release channels for activation by physiological Ca^<2+>entry in bullfrog sympathetic neurones." Neuron. 12. 1073-1079 (1994)
• [Publications] Kuba,K.: "A UV laser-scanning confocal microscope for the measurement of intracellular Ca^<2+>." Cell Calcium. 16. 205-218 (1994)
• [Publications] Kuba,K.: "Ca^<2+>-induced Ca^<2+> release in neurones." Jpn.J.Physiol.44. 613-650 (1994)
• [Publications] 久場健司: "細胞内Ca^<2+>の調節機構" Clinical Neuroscience. 14. 138-142 (1996)
• [Publications] 久場健司: "記憶の神経回路-シナプスでの細胞内Ca^<2+>調節とその役割-" Clinical Calcium. 5. 9-13 (1995)
• [Publications] 久場健司: "シナプス伝達のダイナミクス" 培風館, 146 (1995)