1995 Fiscal Year Annual Research Report
生物発光を用いた遺伝子発現のリアルタイム・モニタリングシステムの開発
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06557005
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
本間 研一 北海道大学, 医学部, 教授 (40113625)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石浦 正寛 名古屋大学, 理学部, 助教授 (20132730)
近藤 孝男 名古屋大学, 理学部, 教授 (10124223)
篠原 一之 横浜市立大学, 医学部, 助手 (30226154)
安倍 博 北海道大学, 医学部, 助手 (80201896)
本間 さと 北海道大学, 医学部, 助教授 (20142713)
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| Keywords | 生物発光 / 遺伝子導入 / ルシフェラーゼ / 神経ペプチド / 細胞培養 / サーカディアンリズム / エコーリン / 形質転換 |
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| Research Abstract |
本年度は、1)ルシフェラーゼ・レポータ遺伝子のマウス線維芽細胞への導入、と2)エコーリン・レポータ遺伝子を導入した形質転換マウスの培養系における生物発光の経時的測定に関する検討をおこなった。
1)ルシフェラーゼ・レポータ遺伝子の導入
pGl3-Basic vectorをSalI/XhoIで切断し、アガロース電気泳動でluciferase遺伝子(luc)断片を分離精製した。次いで、SalI-XhoI luciferase断片をBact-STneoBのSalI部位に挿入し、luciferase遺伝子がβ-actin promotorにparallelに入ったクローンを選択した。培養細胞に遺伝子を移入し、G418耐性のトランスフォーマントを選択し、luciferin培地に添加した。現在、生物発光測定の条件を設定中である。一方、pGFP-1 vectorからGFP-遺伝子断片を分離精製し、これをblund endに変えてpBACt-STneoBのSalI部位に挿入し、GFP-遺伝子を培養細胞に移入して、青色光を照射してGFPの蛍光を測定する方法を検討中である。
2)エコーリン・レポータ遺伝子導入マウス
エコーリン・レポータ遺伝子を神経特異エノラーゼ遺伝子プロモータと供に挿入した形質転換マウスから、視交叉上核を含む視床下部脳組織を器官培養し、培養液中にエコーリンの基質であるセレンテラジンを加えて、生物発光を測定した。生物発光は遊離カルシュウムイオンによって惹起されるので、現在培地のカルシウム濃度など、生物発光測定の条件を設定している。
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[Publications] Yoshihara.T.,et al.: "Effects of restricted daily feeding on neuropeptide Y release in the rat paraventricular nucleus." Am.J.Physiol.(1996 in press).
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[Publications] Yoshihara.T.,et al.: "Prefeeding release of paraventricular neuropeptide Y is mediated by ascending noradrenergic neurons in rats." Am.J.Physiol.(1996 in press).
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[Publications] Liu.Y.,et al.: "Circadian orchestration of gene expression in cyanobacteria." Genes and Development.9. 1469-1478 (1995)
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[Publications] Liu.Y.,et al.: "Bacterial luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria." J.Bacteriol.177. 2080-2086 (1995)
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[Publications] Honma,S.,et al.: "Circadian rhythm and response to light of extracellular glutamate and aspartate in rat suprachiasmatic nucleus." Am.J.Physiol.(1996 in press).
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[Publications] Shinohara,K.,et al.: "Two distinct oscillators in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro." Proc Natl Acad Sei USA.92. 7396-7400 (1995)
