トキソプラズマNTPase遺伝子の検出による新しい診断法の開発

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06557018
• Research Institution: Keio University, School of Medicine,
• Principal Investigator: 浅井 隆志 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (50175163)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上田 正和 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (50142419) ; 奥沢 英一 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (20177166)
• Keywords: 寄生虫 / 原生動物 / トキソプラズマ / NTPase / 遺伝子診断 / PCR / RT-PCR

Research Abstract

本年度は該当研究の最終年度であるので、前年度の実験を継続すると共に現在まで得られたデータを解析して診断法の有用性について検討を行った。トキソプラズマ感染動物及び先天性トキソプラズマ症を疑われた患者検体よりDNAとRNA抽出し、増幅区間約800ベースを標的としたPCR及びRT-PCRを行った。動物実験では前年と同様に標的遺伝子及びmRNAの検出を行い、診断法の基礎的条件をさらに検討した。その結果、テンペレートRNAの抽出条件が以下のように決定された。RNAの抽出;細胞の可溶化液(4M Guanidium thiocyanate,25mM Na-Citrate,0.5% Sarcosyl,0.1M 2-Mercaptoethanol)を細胞あるいは組織の10倍量加えてホモジナイズする。1/10量のNa-Acetate、等量のフェノール、1/5量のクロロホルム/イソアミル(49:1)を加えて、攪拌後15分間氷冷する。これを9250gで15分間4℃で遠心し、上清に等量のイソプロパノールを加えて-70℃で1時間RNAを沈殿させる。次に9250gで20分間4℃で遠心し、沈殿したRNAを真空乾燥後再度細胞の可溶化液をもとの組織と等量加える。これに等量のイソプロパノールを加えて-70℃で一晩RNAを沈殿させる。沈殿したRNAを前述と同様に遠心で集め、75%エタノールで洗浄後乾燥する。先天性トキソプラズマ症を疑われた患者の臨床診断を前年度に引き続き試みたが、両例とも全て陰性であり症例の追加はできなかった。しかし、実用のための基礎的条件は動物実験と前年の症例で全て得られた。

Research Products

• [Publications] Jun-ichi Sanuki et al: "Identification of Entamoeba histolytica and E-dispar cysts in stool by polymerase chain reaction" Parasitol.Res.83. 96-98 (1997)
• [Publications] 浅井隆志、左貫潤一: "急性トキソプラズマ症の新しい検査法" Biomedical News. 23-11. 3-4 (1996)
• [Publications] 左貫潤一、浅井隆志: "赤痢アメーバ症の遺伝子診断" Biomedical News. 23-8. 3-4 (1996)
• [Publications] 浅井隆志、竹内勤: "ニューモシスチス・カリニおよびトキソプラズマの生物学" カレントテラピー. 14-7. 160-164 (1996)