1994 Fiscal Year Annual Research Report
DNAプローブとPCR法によるBacteroides fragilis迅速診断法
| Project/Area Number |
06557020
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokushima |
|---|
Principal Investigator |
大西 克成 徳島大学, 医学部, 教授 (10037400)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鴨頭 峻 大塚製薬(株), 新薬開発部, 主任研究員
秋本 茂 徳島大学, 医学部, 助教授 (10159337)
|
|---|
| Keywords | Bacteroides fragilis / DNAプローブ / PCR / 迅速診断法 / ノイラミニダーゼ / 感染症 / DNA診断 |
|---|
| Research Abstract |
Bacteroides fragilisは、ヒトの腸管内に常在している偏性嫌気性グラム陰性桿菌であるが、日和見感染の起炎菌としての病原体が注目されている。本研究の目的は、B.fragilis感染症に対する適切な治療を行うために不可欠であるDNA迅速診断法を開発することにある。本年度は、我々がすでにクローン化し、その塩基配列を決定したB.fragilis YCH46株のノイラミニダーゼの遺伝子nanHが、迅速診断のためのDNAプローブとして利用可能であることを明らかにした。
1.DNAプローブの菌種特異性の検定:nanH構造遺伝子(1632bp)の内部に存在する325bpのEcoRI-ClaI断片をベクターpBluescriptKSII+にクローン化したプラスミドpKSEC1を作製した。培養法でB.fragilisと同定された臨床分離株及び標準株、計68株についてpKSEC1をDNAプローブとしてセルドットプロットハイブリダイゼイションを行ったところ、すべて陽性であった。一方、B.fragilis以外のBacteroides属の菌種、およびBacteroides属以外の嫌気性菌14種16株はいずれも陰性であった。
2.PCRによる菌数の検出限界の検定:検査材料からの直接検出を想定して、菌数の検出限界の検定を行った。YCH46株のターゲットDNAを増幅しなかった場合は、上記プローブの検出限界菌数は10^5であったが、DNAをPCR法により増幅した場合は20個の菌数があれば十分検出できることがわかった。
今後は、菌株間でnanH遺伝子の相同性の高い部分を利用したプライマーセットの構築とその有効性、非放射性物質を用いて標識したDNAプローブの有効性、臨床材料から本菌を検出するための条件について検討する予定である。
|
-
[Publications] Ono,T.: "Cloning and expression of the Bacteroides fragilis YCH46 neuraminidase gene in Escherichia coli and Bacteroides uniformis" FEMS Microbiol.Lett.121. 153-158 (1994)
-
[Publications] Akimoto,S.: "Complete sequence of the Bacteroides fragilis YCH46 neuraminidase-encoding gene." Biochem.Biophys.Res.Commun.203. 914-921 (1994)
-
[Publications] Sarker.M.F.: "Molecular cloning of the leuB gene from Bacteroides fragilis by functional complementation in Escherichia coli." Microbiol.Immunol.39. 19-25 (1995)
