遺伝子転写過程のイメージングのための超顕微鏡的技術の確立

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06558101
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 臼倉 治郎 名古屋大学, 医学部, 助教授 (30143415)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西沢 祐治 名古屋大学, 医学部, 助手 (80252229) ; 若林 隆 名古屋大学, 医学部, 教授 (00079998)
• Keywords: 転写調節 / 急速凍結 / 低角度回転蒸着 / DNA / CREB / CRP / 原子間力顕微鏡

Research Abstract

本研究は遺伝子の転写過程をイメージングするための方法論を確立するために計画された。このため本年度は急速凍結分子蒸留乾燥法の開発に着手し、ようやく極めて性能の良い機械を作り上げることが出来た。そして、これらの機械を用いて研究を行った。材料として、ソマトスタチン、チロシン水酸化酵素または大腸菌の遺伝子5'側のプロモーター領域を含む約1000塩基を切り出し、TFIID、CREB、CRPなどの転写因子あるいはRNAポリメラーゼと結合させたあと、溶液吸着や噴霧法によりマイカ面上に展開し、その後、直ちに液体ヘリウム温度で急速凍結し、分子蒸留乾燥法により処理し、低角度回転蒸着法や原子間力顕微鏡により観察した。DNAラセン構造の1/2ピッチ(10塩基対)を一つの単位として再現良く観察可能であったので転写調節過程のイメージングに挑戦したCRPやCREBなどの転写因子は結合するとDNAは極僅か曲げることが明かとなった。一方、ポリメラーゼは結合によりDNA鎖を大きく折り曲げる。CREBは二量体であるが、球形で中心に溝をもつことがわかった。溝は二量体をつなぐ橋により形成されるのであるが注意深く観察するとさらにその橋の部分から小さな突起が溝に向かって飛び出しているのが、明かとなった。そして、結合に際し、その突起がDNAの二重鎖の水素結合部位に圧するように結合するのではないかと推測できるような画像も得られた。

Research Products

• [Publications] Liu,X.,Seno,K.,et al.: "Ultrastructural local of retinal guanylate cyclase in human and monkey retinas" Exp.Eye Res.59. 761-768 (1994)
• [Publications] Usukura,J.&Obata,S.: "Morphogenesis of photoreceptor outer segments in retinal development." Prog.Retinal Eye Res.(in press). (1995)