遺伝子転写過程のイメージングのための超顕微鏡的技術の確立

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06558101
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 臼倉 治郎 名古屋大学, 医学部, 助教授 (30143415)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小畑 秀一 名古屋大学, 医学部, 助手 (10204273) ; 若林 隆 名古屋大学, 医学部, 教授 (00079998)
• Keywords: RNAポリメラーゼ / DNA / CRP / CREB / 転写調節 / 低角度回転蒸着 / 原子間力顕微鏡

Research Abstract

本研究は遺伝子の転写過程をイメージングするための方法論を確立するために計画された。昨年度急速凍結分子蒸留乾燥装置を作り上げたが、これを用いた原子間力顕微鏡観察では思わしい結果が出なかったので、DNAやDNA結合蛋白の構造解析はもっぱら低角度回転蒸着法に依存した。我々は分解能の高い蒸着像を得るために高真空のフリーズエッチング装置を開発した。高真空でしかも低温(-110℃)にすることで極めて良質の蒸着像を得ることができた。この方法により現在はDNAラセン構造の@S71PK2@E7ピッチ(5塩基対)を一つの単位として再現良く観察できるかばりでなく、最適な蒸着量の時は塩基対も観察できるようになった。すでにCREBとソフトスタチン遺伝子プロモーターとの結合様式がわかり論文にまとめている。そこで本年度は大腸菌RNAポリメラーゼの構造とミュータントDNA(UV5)との結合にはじまる転写過程の構造解析を試みた。そして、大腸菌のRNAポリメラーゼは四つの大きなドメインからなることを明らかにした。既に生化学的にRNAポリメラーゼはβ,β′αα,σの各サブユニットからなることおよびそれらの分子量が明らかであるので、それらを指針にして低温低角度回転蒸着法で得られたドメイン構造を同定した。RNAポリメラーゼには二つのチャンネルがあるが、ひとつはβ,β′と2αの間にある大きなチャンネルであり、もうひとつはβとβ′との間にスリット状に存在するものである。DNAと結合させたのち、低角度回転蒸着法で観測するとα,β間の大きなチャンネルにDNAが入り込むので、もう一つのチャンネルはmRNAの出てくるところと結論ずけられる。

Research Products

• [Publications] Arai,M.: "Confocal imaging of megamitochondria formation induced by ethanol and hydrazine in culture cells(RL-34)." Bioimages. 3. 25-30 (1995)
• [Publications] Usukura,J.: "Morphogenesis of photoreceptor outer segments in retinal development." Prog.Retinal Eye Res.,. 15. 113-125 (1995)