1996 Fiscal Year Annual Research Report
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06558107
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| Research Institution | University of Tokyo |
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Principal Investigator |
芳賀 達也 東京大学, 医学部, 教授 (30011646)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横山 茂之 東京大学, 理学系研究科, 教授 (00159229)
豊島 近 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (70172210)
藤原 忠美 株式会社ツムラ, 企画開発本部, 課長
佐々木 博美 株式会社ツムラ, 企画開発本部, 部長
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| Keywords | 受容体 / 高次構造 / レセプター / 神経伝達物質 / 伝達物質 / Gタンパク質 / アセチルコリン / ムスカリン |
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| Research Abstract |
ムスカリン受容体m2サブタイプの変異体を定常的に発現させる系を確立した。この変異体は糖鎖結合Aspを変異させ、第三細胞内中央部を除去し、C末端にヒスチジン6残基を融合したもので、発現効率がよく、簡便に精製できることがこれまでの研究で分かっている。約50nmolの受容体を含む21のSf9細胞培養液が1週間で得られる。200nmolの受容体を含む膜標品からCoカラムを用いた単一操作で約50nmolの部分精製標品の調製が可能である。受容体の可溶化、精製にはジギトニンを使用しているが、ジギトニンはリン脂質平面膜の生成を抑制するという問題点がある。種々の界面活性剤の検討を行い、テトラデシルマルトシドにより受容体が比較的安定なことを見出した。現在、ジギトニンをCHAPSまたはテトラデシルマルトシドに変えた標品について2次元結晶化の試みを行っている。受容体は並ぶ傾向が見られるが、結晶化には至っていない。
受容体に結合したリガンド分子のコンフォメーションを解析する目的で、メタコリン(O-acetyl-β-metylcholine)の光学異性体を乳酸から合成した。光学異性体s-メタコリンと部分精製m2受容体の混合物でTRNOEの測定を行っている。非特異的結合に由来する信号の分離を検討中である。
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Research Products
(8 results)
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[Publications] Hayashi,M.K.: "Purification and functional reconstitution with GTP-binding regulatory proteins of hexahistidine-tagged muscarinic acetylcholine receptors(m2 subtype)." J.Biochem.120. 1232-1238 (1996)
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[Publications] Itokawa,M.: "Sequestration of the short and long isoforms of dopamine D2 receptors expressed in Chinese hamster ovary cells." Mol.Pharm.49. 560-566 (1996)
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[Publications] Sanada,K.: "Calcium-bound recoverin targets rhodopsin kinase to membranes to inhibit rhodopsin phosphorylation." FEBS Lett.384. 227-230 (1996)
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[Publications] Haga,K.: "Ca2+-dependent inhibition of G protein-coupled receptor kinase 2 by calmodulin." Biochemistry. 36. 1315-1321 (1997)
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[Publications] Mieda,M.: "Expression of the rat m4 muscarinic acetylcholine receptor gene is regulated by the neuron-restrictive silencer element/repressor element 1." J.Biol.Chem.272. 5854-5860 (1997)
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[Publications] Hayashi,M.K.: "Palmitoylation of muscarinic acetylcholine receptor m2 subtypes:Reduction in their ability to activate G proteins by mutation of a putative palmitoylation site,cysteine 457,in the carboxyl-terminal tail." Arch.Biochem.Biophys.(in press). (1997)
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[Publications] Haga,T.: "Receptor Biochemistry.In:Encyclopedia of Molecular Biology and Molecular Medicine,Volume 5," Academic Press, 19 (1996)
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[Publications] Haga,T.: "G protein-coupled receptor kinase:Phosphorylation of muscarinic receptors and facilitation of receptor sequestration.In:Advances in Pharmacology,volume 36" VCH, 15 (1996)
