ラン藻を利用したndh (NADH脱水素酵素)遺伝子産物の遺伝生化学的解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06640840
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高橋 康弘 大阪大学, 理学部, 助手 (10154874)
• Keywords: ラン藻 / ndh遺伝子 / NAD (P) H脱水素酵素

Research Abstract

葉緑体DNAには、ミトコンドリア内膜の呼吸鎖電子伝達複合体I(NADH:ユビキノン酸化還元酵素)のサブユニットに相同性を示す11種のndh遺伝子群がコードされており、これらの遺伝子産物は、光化学系に連接する系(循環的電子伝達系?)でプラストキノンの酸化還元を担う超分子複合体を構成すると予想されている。私は、ndh遺伝子産物の関与する反応系とその生理的意義について明らかにすることを目的として、明暗所ともに生育できるラン藻Plectonema boryanumを材料として研究を進めており、今回の一般研究(C)ではすでにクローン化したndh1-frxB (ndh8) -ndh6-ndh4Lオペロンを有効に利用することと共に、未知の関連遺伝子を探索することに研究の重点をおくことにした。
研究計画のうち、NAD (P) H結合サブユニット遺伝子の単離を目的とした実験の進行状況は良好であり、新たなndh遺伝子を同定し、遺伝子産物が構成する複合体の機能を予想し生化学的解析を進める上での指針を与えるものと期待される。また、広い意味でのndh関連遺伝子の探索を目的として、タギングによる変異体の作製を試みており、明暗所での生育能の違いを指標にスクリーニングを行い、現在数十種類の変異体を得ている。一方、ndh遺伝子破壊実験と大腸菌における発現産物の調製については、現在なお試行錯誤の段階である。ndh遺伝子破壊実験においては、得られた変異体はいずれも変異遺伝子と野生型遺伝子とが共存するheteroplasmicな遺伝子型を示しており、現在種々の生育条件での選別を繰り返し、その都度数種の単一コロニーからDNAを調製しゲノム解析を行っている。また、大腸菌における発現実験では、ndh遺伝子産物はわずかに同定されるものの、量的に不十分であり精製に至っていない。この点については、ndh遺伝子産物が多くの疎水性(膜貫通)領域を含んでいるため、大腸菌細胞膜の安定性が損なわれているという可能性を考慮し、発現させる領域の縮小と融合蛋白質としての発現を計画している。

Research Products

• [Publications] 南善子: "広く生体反応に関わる鉄硫黄蛋白質" 生物物理. 35. 7-12 (1995)
• [Publications] Hiroshi Matubara: "Three Iron-Sulfur Proteins Encoded by Three ORF_S in Chloroplasts and Cyandobacteria." Photosyn.Res.46. 107-115 (1995)
• [Publications] Yasuhiro Takahashi: "Cyanobacterial Mutagenesis Mediated by Ω-Containing Plasmid." (発表予定).