抗体の変性状態タンパク質認識特性とその分離への応用

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06650912
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 加藤 滋雄 京都大学, 工学部, 助教授 (20026272)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺嶋 正明 京都大学, 工学部, 助手 (30172092)
• Keywords: 抗ペプチド抗体 / 変性タンパク質 / 免疫アフィニティクロマトグラフィー / タンパク質分離 / リフォールディング

Research Abstract

本研究では、封入体形成時の分離工程において、可溶化後弱い変性状態にある目的タンパク質を免疫アフィニティクロマトグラフィーで精製するため、目的タンパク質およびその構成ペプチドに対する抗体の弱い変性状態にあるタンパク質認識特性を検討する。特に、抗ペプチド抗体は立体構造の自由度の高い状態のタンパク質と結合しやすいと考えられるので、変性状態にあるタンパク質の精製に適していると期待される。このような抗体の認識特性とタンパク質の変性状態の関連を明らかにし、リフォールディングと分離に適切な変性剤濃度条件を検討する。本年度の成果としては
1.ミオグロビン、インスリン、イネα-アミラーゼなどのタンパク質およびそのC,N末端ペプチドに対する抗体をウサギに免疫することによって作製し、特異抗体を精製した。これを不溶性担体に固定化したものを調製し、8M尿素等で変性させた後、適当な変性条件(1〜4M尿素など)にしたタンパク質の結合特性を求めた。抗ペプチド抗体は、nativeタンパク質とも結合する場合があったが、変性タンパク質とよく結合し、抗ペプチド抗体を用いれば変性状態での免疫アフィニティクロマトグラフィー精製が可能であることが明らかとなった。
変性タンパク質のリフォールディング条件についてリゾチームを用いて検討し、リフォールディングにさきだって2M尿素等の弱い変性状態に置くことによって、リフォールディング効率が高められることが示された。
以上の結果を得て、予定どおり次年度の研究計画を実施する。