1995 Fiscal Year Annual Research Report
シュードモナス細菌がつくるエチレン生成酵素の基質特異性のタンパク工学的改変
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06650928
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| Research Institution | Kumamoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
小川 隆平 熊本工業大学, 工学部, 教授 (40029244)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長濱 一弘 熊本工業大学, 工学部, 助手 (50248605)
松岡 正佳 熊本工業大学, 工学部, 助教授 (10121667)
福田 秀雄 熊本工業大学, 工学部, 教授 (10150830)
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| Keywords | エチレン / エチレン生成酵素 / Pseudomonas syrimgal / PCR |
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| Research Abstract |
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola PK2のエチレン生成酵素(EFE)と植物由来のEFE酵素は、活性部位と考えられるアミノ酸残基が保存されており、また、両者のハイドロパシープロットは、P. syringaeのEFE遺伝子から疎水性アミノ酸領域(Pro93-Pro114)と親水性アミノ酸領域(Arg209-Ser226)を除くと植物由来のエチレン生成酵素のものと良く一致している。そこで、上記領域を欠失させたEFEを作成し、植物由来のエチレン生成酵素へと構造変換できないか検討することを目的とした。
1.PCR法を用いて欠失EFE遺伝子断片を調整した。この時用いたプライマーはKY6プライマー、KY9プライマー、N末端プライマー、C末端プライマー、KY7プライマーとKY10プライマーの6種類である。
2.得られた疎水部欠失EFE遺伝子(1,000bp)のものと、親水性欠失EFE遺伝子(1,000bp)断片をそれぞれpUC18にライゲーションした。
3.欠失EFE遺伝子断片を含むプラスミドによる大腸菌(Escherichia coli JM109)の形質転換体を作成した。
4.2つの領域をそれぞれ除去したEFE遺伝子を含有するE.coliJM109は、in vivo、in vitroで測定したところ、α-ケトグルタール酸からのエチレン生成酵素活性を消失していた。
5.形質転換体での欠失EFE遺伝子の発現の確認をウエスタンブロッティングで行ったが、現在のところ確認できていない。
今後、疎水部、親水部別々に作成したものから、両者を欠失した断片を作成し、EFEタンパク質の確認を行うとともに、植物EFE活性の測定を行って行きたい。
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