原核生物由来ペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼの構造と機能

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06660105
• Research Institution: Kyoto Institute of Technology
• Principal Investigator: 小田 耕平 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (50081584)
• Keywords: 原核生物 / ペプスタチン / カルボキシルプロテアーゼ / 酸性プロテアーゼ / アスパラギン酸プロテアーゼ / 構造と機能 / 触媒残基 / アミノ酸配列

Research Abstract

本研究は,著者らの発見したペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼ(CP)の構造・機能解析の一環として,ペプスタチン非感受性CPのうち, Pseudomonas sp. CP(PCP)と Xanthomonas sp. CP(XCP)の2つに的を絞って,これら酵素の触媒残基を遺伝子工学的手法と化学修飾法を駆使して同定することを目的とする。これらのCPは,原核生物由来の最初のCPであり, その全一次構造は,既報のCPと全く相同性がない。更に, 既報のCPに例外なく保存されている活性中心アミノ酸配列もない極めて特徴の高いCPである。
1.触媒残基の同定(部位特異的改変体を使用して)
PCP(372アミノ酸残基)とXCP(398アミノ酸残基)の全一次構造は,上述のとおり既報のCPと全く相同性がないが,互いには約52%の相同性を有する。この高い相同性に基づき,触媒残基候補部位8ケ所について,合計11種のAla変異性を作成し,自己触媒的プロセッシングとプロテアーゼ活性を指標に触媒残基の同定を試みた。その結果,これら酵素の触媒残基はD170, E217, E222, D328の4つの候補部位にうち, いずれかの組み合わせで構成される。立体的に隣接した一対のカルボキシル基であることが強く示唆された。
2.触媒残基に同定(チロスタチンを応用して)
両酵素の特異的阻害剤チロスタチン(Isovaleryl-Tryosyl-Leucyl-Tyrosinal, Ki=2.5nM)の阻害部位Tyrosinal側に酵素の触媒残基のカルボキシル基と共有結合できるようにエポキシ環を付け,そのペプチド鎖の長さを変えた4種類の阻害剤を合成し,その効果を調べた。その結果,ペプチド鎖の最も短いZ-Phe-O-OH_2-Epoxideが阻害活性を示し,その阻害は拮抗型であることが判明した。
著者らが発見したペプスタチン非感受性CPの構造・機能解析の一環としてPCP, 及び, XCPの触媒残基の同定を原理の異なる2つの方法で解析を加え,あともう一歩という段階に至った。平成8年度には,結論を得たい。

Research Products

• [Publications] Kohei ODA: "Cloning,Nucleotide Sequence,and Expression of an Isovaleryl Pepstatinigsensitive Cafboxy Proteinase Gene from Pseudomonas sp 101" The Jurnal of Biological Chemistry. 269. 26518-26524 (1994)
• [Publications] Kaeko HAYASHI: "The Primary Structure of Pepstatin-Insensitive Carboxyl Proteinase Producsl by Pseudomonas sp No. 101" The Jurnal of Biochemistry. 118. 738-744 (1995)
• [Publications] Kohei ODA: "Aspartic Proteinases: Structure, Function, Biology, and Biomedical Implications" Plenum Press, New York, 14 (1995)