部位突然変異法を用いたアンジオテンシンIIリセプターの情報伝達機構の解明

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06660107
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 山野 好章 鳥取大学, 農学部, 助教授 (00182593)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森嶋 伊佐夫 鳥取大学, 農学部, 教授 (30032296)
• Keywords: アンジオテンシンII / リセプター / 部位突然変異法 / cDNA

Research Abstract

1.ラットアンジオテンシンIIリセプター(AT_<1A>)のリガンド結合領域の解明
アンジオテンシンIIリセプターで保存されたアミノ酸残基を選び、本リセプターの立体構造解析結果と併せてアンジオテンシンII結合残基を推定した。その結果、第4トランスメンブレン領域のArg^<167>、第5トランスメンブレン領域のLys^<199>、さらに第6トランスメンブレン領域のTrp^<253>、Phe^<259>、Asp^<263>の関与することが推定された。これらの残基を部位突然変異法によりいずれもアラニンに置換し、COS7細胞において発現させた。その結果、いずれの変異体においてもKd値の大きな上昇が認められ、これらの残基がアンジオテンシンIIの結合に関わっていることが明らかになった。またいずれの変異体においてもリセプター坑体を用いることにより正常に発現していることが確認できた。一方、AT_<1A>特異的拮抗薬(EXP985、losartan)の本リセプターへの結合についても検討したところArg^<167>変異体の場合には大きなKd値の上昇が認められたがAsp^<263>変異体の場合のKd値の上昇はわずかであった。以上の結果よりAT_<1A>におけるリガンド結合に関わる残基はアンジオテンシンIIと拮抗薬とでは異なることが明らかになった。他の変異体に対する拮抗薬の結合実験は現在行っており、AT_<1A>に対するリガンド結合機構に関する情報をもとにして新規の拮抗薬の開発を行いたい。
2.ニワトリの肝臓由来のcDNAライブラリーの構築
鳥類にはAT_1、AT_2のいずれにも属しないリセプターの存在が報告されている。ニワトリ肝臓由来のmRNAを用いてラットAT_<1A>cDNAをプローブとしたノーザンハイブリダイゼーションの結果約2Kbの位置にシグナルを得た。現在cDNAライブラリーを構築中である。

Research Products

• [Publications] Yoshiaki Yamano: "Cloning of cDNA for cecropin A and B,and expression of the genes in the silkworm,Bombyx mori" Biosci.Biotech.Biochem.58. 1476-1478 (1994)
• [Publications] Shigeyuki Chaki: "Role of carboxyl tail of the rat angiotensin II type IA receptor in agonist-induced internalization of the receptor" Kidney International. 46. 1492-1495 (1994)
• [Publications] 駒野 徹: "生物化学実験法 33 組換えDNA実験入門" 学会出版センター, 237 (1994)