N-ミリストイル融合蛋白質の作製による新規膜局在性酵素製剤の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06660112
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 内海 俊彦 山口大学, 農学部, 助教授 (20168727)
• Keywords: 腫瘍壊死因子 / 蛋白質N-ミリストイル化 / ドラッグデリバリーシステム / リポソーム

Research Abstract

酵素製剤等の蛋白性薬物のリポソーム結合性ドラッグデリバリーシステムの開発を目的として、蛋白質の活性を損なうことなく、目的蛋白質にリポソーム結合性を付与する方法として、目的蛋白質-cDNAの5'-末端に、遺伝子工学的手法によりN-ミリストイル化シグナル配列を導入してN-ミリストイル融合蛋白質遺伝子を構築し、これをバキュロウィルスを用いた発現系を用いることにより大量調製する手法の確立を試み、以下の結果を得た。
6年度の研究で得られた2種のN-ミリストイルTNF融合蛋白質遺伝子についてin vitro転写・翻訳系により蛋白合成効率ならびにミリストイル化効率を検討した結果、両融合遺伝子ともに効率良い蛋白合成ならびにミリストイル化が認められた。
このうちRasheed leukemia virus gag-蛋白質のミリストイル化シグナルを組み込んだ融合遺伝子をバキュロウィルス発現系のトランスファーベクターpACYM1中に挿入しバキュロウィルスDNAとともに夜盗蛾培養細胞にトランスフェクションしたところ、抗TNF抗体で免疫沈降される分子量18kDaの融合TNFの発現が確認された。さらにこの組み換えウイルス感染細胞を[^3H]-ミリスチン酸存在下で培養することにより、融合TNF分子中に特異的な[^3H]-ミリスチン酸の取り込みが生ずることが明らかになり、バキュロウィルス発現系によりミリストイル化融合TNFの大量発現が可能であることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] T.Utsumi et al.: "Human pro-tumor necrosis factor : Molecular determinants of membrane translocation,sorting,and maturation" Mol.Cell.Biol.15. 6398-6405 (1995)
• [Publications] T.Utsumi et al.: "In Vitro synthesis of an N-myristoylated fusion protein that binds to the liposomal surface" Arch.Biochem.Biophys.(in press).