組換え体セントロメア蛋白質のDNA結合能を用いたセントロメアDNAの単離

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06660120
• Research Institution: University of Osaka Prefecture
• Principal Investigator: 杉本 憲治 大阪府立大学, 農学部, 講師 (40196746)
• Keywords: セントロメア蛋白質 / DNA結合能 / セントロメアDNA

Research Abstract

1。DNA結合能を持つ新たなセントロメア蛋白質をコードする遺伝子の同定
DNA結合活性を持つセントロメア蛋白質(CENPs)を同定するため、ヒトcDNAライブラリーより抗セントロメア血清に反応するクローンをスクリーニングし、この中からセントロメア蛋白質B(CENP-B)、セントロメア蛋白質C(CENP-C)、ヘテロクロマチン蛋白質1(HP1)をコードする遺伝子を得た。大腸菌に発現させた組換え体蛋白質を用いた解析により、これらがDNA結合能をもつことを明らかにした。続いて、ゲル移動度シフト法、サウスウェスタンブロット法によりこれらの蛋白質のうち、DNA結合能を持つ領域の限定を行った。その結果、CENP-BについてはN末端135アミノ酸残基の領域に、CENP-Cは内部の104アミノ酸残基の領域に、HP1については内部の64残基の領域に存在することが明らかとなった。また、CENP-CとHP1については、そのアミノ酸配列に類似性が存在した。
2。DNAアフィニティー沈降法を用いたCENP-B結合配列の単離
ヒトCENP-Bについてはセントロメア領域のサテライト(アルホイド)に存在する幾つかの配列に結合することが知られているが、その結合配列の詳細は不明であった。そこで、標的配列を単離・解析するため、ヒト組換え体CENP-Bを用いたDNAアブィニティー沈降法を開発した。これを用い、ヒトゲノムライブラリーより、CENP-Bの結合するセントロメアルホイドDNAを単離した。実際、塩基配列を解析した結果、新たなCENP-B結合配列が存在していた。

Research Products

• [Publications] K. Sugimoto, Y. Hagishita, and M. Himeno: "Functional domain strucuture of human centromere protein B : Implication of the internal and C-terminal self-association domains in centromeric hetero-chromatin condensation." Journal of Biological Chemistry. 269. 24271-24276 (1994)
• [Publications] K. Sugimoto, K. Furukawa, and M. Himeno: "Functional cloning of centromere protein B (CENP-B) box-enriched alphoid DNA repeats utilizing the sequence-specific DNA binding activity of human CENP-B in vitro." Chromosome Research. 2. 453-459 (1994)
• [Publications] K. Sugimoto, H. Yata, Y. Muro, and M. Himeno: "Human centromere protein C (CENP-C) is a DNA-binding protein which possesses a novel DNA-binding motif." Journal of Biochemistry. 116. 877-881 (1994)
• [Publications] K. Sugimoto, T. Yamada, Y. Muro, and M. Himeno.: "Human homolog of Drosophila heterochromatin-associated protein 1 (FPT) is a DNA-binding protein which possesses a DNA-binding motif with weak similarity to that of human centromere protein C (CENP-C)." Journal of Biochemistry. 120. 153-159 (1996)
• [Publications] Kenji Sugimoto: "DNA-protein interaction involved in centromere heteochromatin organization of human chromsome." Viva Origino. 24. 211-224 (1996)
• [Publications] K. Sugimoto, K. Kuriyama, A. Shibata, and M. Himeno: "Characetrization of internal DNA-binding and C-terminal dimerization domains of human centromere/kinetochore autoantigen CENP-C in vitro : Role of DNA-binding and self-associating activities in kinetochore organization." Chromosome Research. 5. 1-10 (1997)
• [Publications] Kenji Sugimoto: "DNA immunoprecipitation : Application to characterization of target sequences for a human centromere DNA-binding protein (CENP-B) in " Cell Biology : A Laboratory Handbook "" J. E. Celis, Academic Press, 9 (1994)
• [Publications] K. Sugimoto, Y. Muro, M. Ohashi, and M. Himeno.: "Scleroderma diagnosis with recombinant protein. in " Encyclopedia of Molecular Biology and Molecular Medicine "" R. A. Meyers, VCH Publishers, 11 (1997)