急速凍結・ディープエッチング法による赤芽球分化過程における膜骨格の研究

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06670016
• Research Institution: 山梨医科大学
• Principal Investigator: 大野 伸一 山梨医科大学, 医学部, 教授 (50109170)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤井 靖久 山梨医科大学, 医学部, 助手 (60126703)
• Keywords: 赤芽球 / 膜骨格 / 急速凍結技法 / ディープエッチング法

Research Abstract

赤血球膜細胞質側にはスペクトリンがアクチン、バンド4・1などと結合して網目状構造を形成している。さらにこの構造は細胞膜脂質二重層を貫通しているバンド3やグリコフォリンに結合して、赤血球膜を安定化していると考えられている。そこで赤芽球膜細胞質側を分子レベルの高解像力で三次元的に解析することができる急速凍結・ディープエッチング法を開発し、さらに膜骨格蛋白の抗体を作成し、超微形態学的に検索した。1.赤芽球内可溶性蛋白質除去法:(1)グルタールアルデヒドとアミノプロピルトリエトキシシランを被覆した2枚のカバーグラス間で赤芽球をはさみ二分割した。(2)一部の試料は2%パラフォルムアルデヒドで30〜60秒間固定後、上記の方法で二分割した。2.次いで液体窒素冷却イソペンタン・プロパン混合液中で急速凍結した。3.FD-3AS装置内(-95℃、2-6X10^<-7>Torr)でディープエッチングをかけた。4.白金と炭素を回転蒸着して、型のごとくレプリカ膜を作製した。5.モノクロナール抗体の作成:(1)ヒト赤血球膜より、スペクトリン蛋白を精製した。(2)その蛋白をBALB/Cマウスに免疫後に、脾臓を摘出し、リンパ球を採取した。(3)培養ミエローマ細胞と融合させてモノクロナール抗体を作成した。(4)作成されたモノクロナール抗体を電気泳動システムで反応させて、抗体の調整を行った。6.可溶性蛋白質を除去した赤血球膜細胞質側を、調整されたスペクトリン蛋白に対するモノクロナール抗体で免疫染色後にレプリカ膜を作製して、網目状の超微形態学局在を明らかにした。7.さらに赤芽球膜細胞質側の超微形態学的変化を同様の方法で検索し、スペクトリン蛋白以外の細線維構造を認め、発生学的検討を加えた。

Research Products

• [Publications] Shinichi Ohno et al.: "Membrane skeletons in fresh unfixed erythrocytes as revealed by a quick-freezing and deep-etching method" J.Anat.185. 415-420 (1994)
• [Publications] 大野伸一他: "急速凍結・ディープエッチング(QF-DE)法による新鮮無固定赤血球膜細胞質側の微細構造" 解剖学雑誌. 69. 470-470 (1994)
• [Publications] Nobuo Terade et al.: "Cytoskeletons of chicken erythrocytes revealed by quick-freezing and deep-etching method" 14th Fed.Inter.Cong.Anat.(発表). (1994)
• [Publications] 寺田信生他: "急速凍結・ディープエッチング法によるニワトリ楕円状有核赤血球内微細構造の解析" 日本解剖学会第82回関東地方会. (発表). (1994)
• [Publications] 大野伸一: "組織細胞化学1994年(急速凍結・ディープエッチングレプリカ法)" 学際企画(日本組織細胞化学会編), 249ページ (1994)