胃癌・大腸癌の進展において重要な染色体異常をDNA分子雑種法によって同定する試み

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06670199
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 杉原 洋行 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (30171169)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木谷 奏 (桂 奏) 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (60234259)
• Keywords: DNA分子雑種法 / 染色体異常 / 間期核細胞遺伝学 / 胃・大腸癌 / DOP-PCR

Research Abstract

1.あらかじめC-mycの増幅がわかっている大腸癌細胞株Colo320と、N-mycのわかっている神経芽細胞腫の培養株(C-mycの増幅が25倍及び50倍)を用いて、CHGを試みた。腫瘍から抽出したDNAをbiotin標識してprobeとし、それを単独で、あるいはdigoxygenin標識したcompetitor DNAの存在下で、正常リンパ球の染色体展開標本に対してhybridizeさせ、腫瘍DNAをFITC、competitor DNAをTRITCで検出した。その結果、神経芽細胞腫のN-myc50倍増幅のある株で、2番染色体の短腕に、Colo320では8番染色体の長腕に濃いFITC優位のバンドが見られた。また、神経芽細胞腫のlineにはlp-が核型から分かっているものがあり、それでCGHを行うと、lpのtipに近い部分のFITC蛍光が減弱しているのが確認できた。ただし、蛍光強度の比からコピー数の推定を定量的におこなうための、プログラムは現在は引続き開発中である。CGHからlp-のパタンがみれた神経芽細胞腫のcell lineで、lp36とcentromereを認識するrepetitive probesを組み合わせてdual color FISHを行ったところ、centromere signalのsize polymorphismのみられた一例でLOHが確認できた。
この方法を胃癌・大腸癌の新鮮組織に応用してこれらの癌で高頻度に異常の見られる染色体(の部分)の同定を試みるために、この一年間で、大腸癌23例、早期胃癌8例の同一病巣から複数箇所の新鮮材料とAmex固定材料を収集した。正常細胞のDNAの混入を最小限にするように、50μm程度の厚切り切片から実体顕微鏡下で腫瘍部分のみをmicrodissectした組織から細胞浮遊液を作ってDNAを抽出した。その際、どのくらい小さな組織からDNAを抽出できるかを検討するため、suspensionの限界希釈法を用いて、DOP-PCRを行った。その結果、腫瘍細胞核10から100個あればprobeにできる程度のDNAが得られることが分かった。次年度はこの方法で、いよいよ採取した原発腫瘍例でCGHの検索を重ねて行く予定である。

Research Products

• [Publications] 杉原 洋行、他: "顕微鏡トモグラフィによる間期染色体の3次元観察" 生体の科学. 45. 221-225 (1994)
• [Publications] 杉原 洋行、桂 奏、他: "Ploidy heterogeneityとras mutationからみた大腸癌の進展" 癌と化学療法. (in press). (1995)
• [Publications] 中井 茂、桂 奏、他: "Diploid頭頸部扁平上皮癌の染色体数的異常-FISH法を用いて" 癌と化学療法. (in press). (1995)
• [Publications] 杉原洋行、桂 奏、他: "新しい光学顕微鏡 第二巻 共焦点レーザ顕微鏡の医学・生物学への応用" 学際企画(in press), (1995)