1994 Fiscal Year Annual Research Report

アデノウイルスベクターを用いた目的蛋白の新しい大量産生法の開発

Research Project

Project/Area Number	06670320
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	斎藤泉東京大学, 医科学研究所, 助教授 (70158913)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	鐘ヶ江裕美東京大学, 医科学研究所, 助手 (80251453)
Keywords	ウイルスベクター / 遺伝子治療 / リコンビナーゼ / Cre / HBs抗原 / COS細胞 / 複製起点
Research Abstract	COS細胞とSV40の複製起点(ori)を併用した蛋白の大量発現系は広く研究室レベルで用いられているが、トランスフェクションによる遺伝子導入法では全細胞の10〜20%しか利用することができない。一方組換えアデノウイルスはCOS細胞を始めとして各種細胞へ高い遺伝子導入効率を示すが、直鎖状の遺伝子のため単独ではSV40系の正確な複製をおこす環状分子は生成しない。そこで組換えアデノウイルスと部位特異的リコンビナーゼCreを併用し、100%のCOS細胞へ複製可能な環状分子を導入する大量発現系(Ad-COS法)の確率を目的として研究を行った。Creは34bpのloxP配列を認識し、相同組換えに必要な一連の反応を単独で行うことが知られている。そこでSV40 oriと発現マーカーであるB型肝炎表面抗原(HBs)発現単位の両側にloxP配列をもつ組換えアデノウイルス(環状分子生成ウイルス)とCre発現組換えアデノウイルスを作成しCOS-1細胞へ同時感染した。その結果Creが発現することにより、環状分子生成ウイルス上のloxP配列で特異的な相同組換えを起こし、100%の細胞で設計どうりの環状分子が生成していたことがサザン法により明らかとなった。また生成した環状分子は3日目に最高500コピーにまで複製していた。Ad-COS法は、100%のCOS細胞へ複製可能な環状分子を導入する系であることが示されたので、従来のトランスフェクション法とAd-COS法での発現量をHBsのELISA法で測定し比較した。従来法は環状分子生成ウイルスと同じインサートを有するプラスミドをカルシウム法により遺伝子導入した。導入7日目までの発現蓄積量を比較したところAd-COS法では従来法の約5倍の発現量である8mg/リットルにまで達していることが示された。組換えアデノウイルスは神経や肝細胞等へも高い遺伝子導入効率を示すので、今後Ad-COS法とSV40T抗原発現組換えアデノウイルスを併用することで各種細胞における大量発現系の確立への発展性が示唆された。

Research Products

(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] Y.Kanegae et al.: "A simple and efficient method for purification of infectious recombinant adenovins" Jpn.J.Med.Sci.Biol.47. 157-166 (1994)
[Publications] H.Sakamoto et al.: "Adenovirus-mediated transfer of the HST-1(FGF4) gene induced incheased levels of platelet count in vivo" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91. 12368-12372 (1994)
[Publications] Y.Nakamura et al.: "Adoptive immunotherapy with murine tumor-specific T lyphocytes engineered to secrete interleurin 2" Cancer Research. 54. 5757-5760 (1994)
[Publications] H.Chang et al.: "Highly efficient adenovirus-mediated gene transfer into renal cells in culture" Kiduey international. 47. 322-326 (1995)
[Publications] S.Harada et al.: "Establishment of a cell line constitatively expressing E2 glyeoprotein of hepatitis C virus and humoral responce・・・" J.Gen.Virol.(in press). (1995)
[Publications] 鐘ヶ江裕美他: "アデノウイルスベクターによる遺伝子導入" 実験医学(増刊)羊土社. 12. 1804-1810 (1994)

1994 Fiscal Year Annual Research Report

アデノウイルスベクターを用いた目的蛋白の新しい大量産生法の開発

Principal Investigator

斎藤 泉 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (70158913)

Research Products

[Publications] Y.Kanegae et al.: "A simple and efficient method for purification of infectious recombinant adenovins" Jpn.J.Med.Sci.Biol.47. 157-166 (1994)

[Publications] H.Sakamoto et al.: "Adenovirus-mediated transfer of the HST-1(FGF4) gene induced incheased levels of platelet count in vivo" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91. 12368-12372 (1994)

[Publications] Y.Nakamura et al.: "Adoptive immunotherapy with murine tumor-specific T lyphocytes engineered to secrete interleurin 2" Cancer Research. 54. 5757-5760 (1994)

[Publications] H.Chang et al.: "Highly efficient adenovirus-mediated gene transfer into renal cells in culture" Kiduey international. 47. 322-326 (1995)

[Publications] S.Harada et al.: "Establishment of a cell line constitatively expressing E2 glyeoprotein of hepatitis C virus and humoral responce・・・" J.Gen.Virol.(in press). (1995)

[Publications] 鐘ヶ江裕美 他: "アデノウイルスベクターによる遺伝子導入" 実験医学(増刊)羊土社. 12. 1804-1810 (1994)

斎藤泉東京大学, 医科学研究所, 助教授 (70158913)

[Publications] 鐘ヶ江裕美他: "アデノウイルスベクターによる遺伝子導入" 実験医学(増刊)羊土社. 12. 1804-1810 (1994)