Ito cellを標的としたリボザイム導入によるコラーゲン遺伝子発現抑制の試み

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06670584
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 加川 建弘 東海大学, 医学部・第三内科, 講師 (30245469)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中野 敦史 東海大学, 医学部・第三内科, 助手 (20246094) ; 渡辺 勲史 東海大学, 医学部・第三内科, 助教授 (90167156)
• Keywords: コラーゲン / 肝硬変症 / イト-細胞 / リボザイム

Research Abstract

1.Ito cellの単離:灌流法、パーコール比重遠沈法にて高純度に(90%以上)Ito cellを単離することが可能であった。またその技術にも習熟し安定したIto cellの分離が可能となった。
2.I型コラーゲン遺伝子のクローニング:既知のラットI型プロコラーゲンα1鎖遺伝子配列より作成したプライマー用いて、RT-PCR法にて目的の遺伝子を増幅(平成6年度に購入したサーマルサイクラ-を使用)、pT7Blue T-vectorに挿入した。
3.リボザイムの作製:ラットI型プロコラーゲンα1鎖のcDNAの遺伝子配列のトリプルヘリックスドメインからGTC配列を検索し、切断部位を決定した。一方にT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含んだオリゴプライマーを用いてPCR法(平成6年度に購入したサーマルサイクラ-を使用)にてDNAテンプレートを作製、T7 RNAポリメラーゼにてRNAに転写することによってハンマーヘッド型リボザイムを作製した。
4.Cell-free系での検討:プロコラーゲン遺伝子をin vitroでRNAに転写し、リボザイムを種々の濃度で添加した。予想された部位でI型プロコラーゲンα1鎖mRNAの切断が確認されたが、切断効率はあまり高くなかった。
5.今後の展開:リボザイムの切断効率が悪く、今後別の部位、あるいはリボザイムの配列を変えて、切断効率を上昇させる必要があると考えられた。したがって当初平成6年度に行う予定であったレチノイン酸との架橋は効率の良いリボザイムが作成できてから行う予定である。