Ito cellを標的にしたリボザイム導入によるコラーゲン遺伝子発現抑制の試み

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06670584
• Research Institution: TOKAI UNIVERSITY
• Principal Investigator: 加川 建弘 東海大学, 医学部・第三内科, 講師 (30245469)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中野 敦史 東海大学, 医学部・第三内科, 助手 (20246094) ; 渡辺 勲史 東海大学, 医学部・第三内科, 助教授 (90167156)
• Keywords: コラーゲン / 肝硬変症 / イト-細胞 / リボザイム

Research Abstract

1.リボザイムの作成:平成6年度に作製したリボザイムは切断効率が低く、細胞導入した際の効果が疑問視されるため、再度ラットI型プロコラーゲンα1鎖のcDNAから標的部位の選定、リボザイムの作成を行った。その際、コンピュータプログラムにて、標的RNA、リボザイムRNAの2次構造を検討した。
2.リボザイム切断効果の検討:32p標識した標的RNAにリボザイムを添加し、37℃でincubeteした。
(1)時間依存性:添加30分後から切断断片が認められ、時間経過とともに切断効果が増強した。最大で約70%の切断効果が認められた。
(2)濃度依存性:標的RNAとリボザイムのモル比が1:1、1:5、1:10とリボザイム濃度を増加させても切断効果の増強は得られず、モル比が1:1ですでに切断活性がmazimumに達していると考えられた。
(3)マグネシウムイオン依存性:マグネシウムイオン不添加では切断活性が認められず、10mM添加で最大の切断効果が得られた。
3.分離Ito cellに対する影響:分離Ito cellにリボザイムを各濃度で添加し、37℃で培養した。1時間毎に12時間後まで細胞を回収、AGPC法にてRNAを抽出した。rat type I collagen α(1)遺伝子のリボザイムの切断部位より下流の配列に相補的なoligo DNAを32p labelしてプローブとし、northernblottingを行ったが、切断効果はわずかしか得られず、labelしてプローブとし、northern blottingを行ったが、切断効果はわずかしか得られず、細胞内導入方法に課題が残った。
4.今後の展開:ウイルスベクターなどを用いた細胞導入法を検討中である。