1994 Fiscal Year Annual Research Report
ホロカルボキシラーゼ合成酵素の遺伝子の単離とその発現に関する研究
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06670761
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
鈴木 洋一 東北大学, 医学部, 助手 (80216457)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松原 洋一 東北大学, 医学部, 助教授 (00209602)
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| Keywords | ホロカルボキシラーゼ合成酵素 / ビオチン / 遺伝子座位 / 遺伝子クローニング |
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| Research Abstract |
ヒト・ホロカルボキシラーゼ合成酵素(HCS)遺伝子の単離はヒトHCScDNAをプローブとして、pWEX15ヒトゲノムコスミドライブラリーをスクリーニングして単離した。このクローンが正しいことは、ヒトゲノムと単離したコスミドクローンDNAを制限酸素EcoRI、BglII、HindIII、PstIで消化し、サザン解析を行ったところ、両者に共通の大きさのバンドが検出されたこと、ゲノムDNAとコスミドクローンDNAを鋳型としてpolymerase chain reaction(PCR)にて、同じ大きさのPCR産物が認められることで確かめた。
単離したゲノムクローンをプローブとしたfluorescence in situ hybridizationによるマッピングでは、HCS遺伝子は21番染色体q22.1に局在するとの結果を得た。PCRを利用したヒト・ハムスター雑種細胞のDNAパネル解析からも、HCS遺伝子は21番染色体にあると推定された。110bpのHCScDNAの断片をプローブとしてゲノムサザン解析では、EcoRI、BglII、HindIII、PstI消化で、単一のバンドを示した。以上の結果から、HCS遺伝子はハプロイドあたり1つで、偽遺伝子の存在は否定的と考えられた。
次に、HCS遺伝子の大きさを推定するため、ヒトHCScDNAの全長をプローブとし、BamHI、BglII、EcoRI、EcoRVで消化したヒトゲノムのサザン解析を行った。その結果、BamHIでは11.0、6.8、4.0、3.5kb、BglIIでは9.2、7.0、2.8、0.9kb、EcoRIでは6.8、6.2、3.4、1.9kb、EcoRVでは10.6、6.8kbのバンドが検出された。それぞれのバンドの長さを合計すると、BamHIでは25.3kb、BglIIでは19.9kb、EcoRIでは18.3kb、EcoRVでは17.3kbとなり、ヒトHCS遺伝子の大きさはたかだか約25kbであると推定された。
単離したコスミドクローンをNotIで消化すると、そのインサートは12.5、9.4、4.5kbの3本の断片となった。これらの断片の合計は約26kbとなり、従って単離したクローンはHCS遺伝子の大部分をカバーしていると推定された。現在BglII、EcoRI、HindIII、SprI消化によって制限酵素地図の作成を行っている。
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[Publications] Chiba,Y.,Suzuki,Y.et al.: "Purification properties of bovine liver holocarboxylase synthetase" Archives of Biochemstry and Biophysics. 313. 8-14 (1994)
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[Publications] Suzuki,Y.et al: "Isolation and chracterization of nutations in the human holocarbosylase synthetase cDNA." Nature Genetics. 8. 122-128 (1994)
