新しい神経細胞修復機序の解明“脳の老朽化蛋白修復酵素の遺伝子解析"

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06670965
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 溝渕 睦彦 愛媛大学, 医学部・附属病院, 講師 (00166042)
• Keywords: 蛋白メチル化酵素 / PCR / Competitive PCR / in situ ハイブリダイゼーション / cDNA cloning

Research Abstract

PCRを用いてcDNAをクローニングする方法は、現在まで幾つか報告されている。われわれも、nested RACE法を用い、種々のcDNAの構造解析を行なってきた。しかし、既報のいずれの方法も、cDNAの長さやRNAの立体構造上の問題などから多くの限界がある。今回われわれは、cDNAライブラリーを鋳型とし、ベクターDNAと目標とする遺伝子の既知部分のプライマーを用い、二段増幅し、簡単に迅速決定する方法を確立した。この方法は、サザンブロット分析なしに、5′と3′両方向にcDNA walkingが可能である。この方法を用いて、ヒト脳の蛋白カルボキシメチル化酵素のcDNA配列を決定した。
また、本酵素は、広く哺乳類に存在し、脳、睾丸と赤血球に酵素活性が高く、ノーザンブロット分析でも本酵素の遺伝子は、脳と睾丸に強く発現している。そこで、in situハイブリダイゼーション法を用いて、PIMT遺伝子発現のラット脳での局在性を分析した。脳と睾丸以外での組織では、反応はほとんど認められなかった。脳では、神経細胞に特異的に反応が認められた。海馬のCA1およびCA3領域の錘体細胞層に主に局在し、大脳皮質では各層に散在していた。しかし、被殻尾状核には反応はほとんど認められなかった。
さらに、我々はPCRのArtifact産物をIntermal Standardとして利用する新しいCompetitive PCRの開発に成功した。この方法を用いて、微量の脳下垂体での本酵素のmRNAを定量した。

Research Products

• [Publications] Makoto Sato: "Simple quantitative reverse transcribed-polymerase chain reaction(RT-PCR)method involving recombinant RNA generated by a false-priming PCR product." Journal of Biochemistry. 116. 1198-1201 (1994)
• [Publications] Ryohei Takeda: "Characterization of three cDNA encoding two isozymes of isoaspartyl protein carboxyl methyltransferase from human erythroid leukemia cells." Journal of Biochemistry. (in press). (1995)
• [Publications] 武田良平: "ラット脳におけるisoaspartyl protein carboxyl methyltransferaseの遺伝子発現“in situ ハイブリダイゼーション法を用いて"" 神経化学. 33. 336-337 (1994)
• [Publications] 児玉俊夫: "ヒト脳組織における蛋白カルボキシメチル化酵素の遺伝子発現" 神経化学. 33. 332-333 (1994)
• [Publications] 佐藤誠: "Artifactを利用したcompetitive PCR“脳下垂体の蛋白メチル化酵素mRNAの定量化" 神経化学. 33. 340-341 (1994)
• [Publications] 溝渕睦彦: "A Simple Protocol for Amplification of cDNA Euds(SPACE)法“ヒト脳の蛋白カルボキシメチル化酵素のcDNA"" 神経化学. 33. 622-623 (1994)